凝血因子Ⅶ与Ⅹ联合缺陷患者误食鼠药导致的表型变化及相关分析

谢耀盛，金艳慧，谢海啸，杨丽红，朱丽青，王明山

（温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

·论 著·

凝血因子Ⅶ与Ⅹ联合缺陷患者误食鼠药导致的表型变化及相关分析

谢耀盛，金艳慧，谢海啸，杨丽红，朱丽青，王明山

（温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

目的：探讨1例遗传性凝血因子VⅡ（FVⅡ）与因子X（FX）联合缺陷症患者误食敌鼠钠后实验室表型特点及其相关分析。方法：对1例误食敌鼠钠患者进行止凝血指标初筛试验和凝血因子促凝活性的多次检测，并在多个疗程（大于1年）治疗后用DNA直接测序法对患者及家系成员进行相关凝血因子基因分析及抗原等测定，同时选择106例健康体检者作对照。结果：患者敌鼠钠中毒后治疗前实验室检查首次结果为凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）明显延长，分别为102.4 s和88.5 s；凝血因子Ⅱ、VⅡ、IX、X促凝活性明显减低，分别为7%、3%、8%和2%；在1年多治疗期间多次复查PT、APTT仍明显延长，FVⅡ、FX促凝活性为5%左右，而FⅡ、FIX促凝活性在治疗1周后逐渐回升，12周后基本维持在正常水平。患者F7基因分析g.11267C＞T的纯合突变导致Arg277Cys，F10基因g.28139G＞T的纯合突变导致Val384Phe，其父亲、母亲、姐姐均存在F7基因g.11267C＞T和F10基因g.28139G＞T杂合子。患者FVⅡ及FX抗原分别为7%、30%。结论：遗传性FVⅡ与FX联合缺陷症患者的实验室检查特点极似获得性维生素K缺乏症，基因分析是区别两者的有效方法。

因子VⅡ缺乏；因子X缺乏；突变；血液凝固障碍；中毒

遗传性凝血因子VⅡ（FVⅡ）和因子X（FX）缺陷是罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病，遗传性FVⅡ与FX联合缺陷的实验室检查可表现为凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）明显延长，FVⅡ促凝活性（FVⅡ∶C）与FX促凝活性（FX∶C）减低，并且遗传性FVⅡ与FX缺乏症的实验室表型与基因突变位点及数量，以及对功能的影响程度等紧密相关[1-3]。敌鼠钠盐是常用的一种高效抗凝血杀鼠剂，可抑制肝脏合成维生素K依赖的凝血因子Ⅱ、VⅡ、IX、X，影响凝血活酶及凝血酶原酶的合成，表现为PT、APTT延长和FⅡ促凝活性（FⅡ∶C）、FVⅡ∶C、FIX促凝活性（FIX∶C）、FX∶C减低[4]。本研究对1例遗传性FVⅡ与FX联合缺陷症患者误食敌鼠钠盐后进行止凝血指标初筛试验和凝血因子促凝活性的多次检测及相关凝血因子的基因分析，探讨其治疗过程中的实验室检查特点及与获得性维生素K缺乏症的鉴别诊断。

1 资料和方法

1.1 一般资料 遗传性FVⅡ与FX联合缺陷症患者为男性，年龄16岁，因误食拌有老鼠药（敌鼠钠）的食物后来院就诊，就诊时仅有轻微的恶心、呕吐、腹部不适等消化道症状，凝血常规检查发现PT 102.4 s，APTT 88.5 s，FⅡ∶C、FVⅡ∶C、FIX∶C、FX∶C明显减低，分别为7%、3%、8%和2%，其他常规凝血指标和因子活性检测均无异常，肝肾功能正常，平素无明显出血症状，拟诊断为“老鼠药中毒”予以维生素K等治疗。用维生素K或凝血酶原复合物治疗期间多次复查PT、APTT仍明显延长，FVⅡ∶C和FX∶C维持在5%左右，FⅡ∶C和FIX∶C恢复到正常范围内。患者父母否认近亲婚配。

选择106例我院健康体检者作为健康对照组，男62例，女44例，平均年龄32（16～60）岁。对照组经查均无肝肾功能疾病，无血栓或出血史，经过凝血因子活性检测，所有受试者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集：征得患者及其家属同意后，采集研究者及其家属成员的外周静脉血液标本，用0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝标本。标本采集后，一份用于凝血表型指标检测；另一份则用于标本DNA的提取，在-80 ℃冰箱中保存待检。

1.2.2 血浆凝血表型项目检测：检测研究标本的PT、APTT、纤维蛋白原（FIB）、FⅡ∶C、FV促凝活性（FV∶C）、FVⅡ∶C、FIX∶C、FX∶C等各项指标，仪器使用STAGO STA-R全自动血液凝固分析仪，试剂盒由法国STAGO公司配套提供，所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。FVⅡ抗原（FVⅡ∶Ag）和FX抗原（FX∶Ag）采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测（由上海交通大学附属瑞金医院血栓与止血实验室提供检测）。

1.2.3 DNA模板的提取：用树脂型基因组DNA提取试剂盒抽提全血标本中的单个核细胞的基因组DNA，抽提试剂盒购自上海赛百盛生物工程有限公司。

1.2.4 PCR扩增：PCR试剂2×Taq PCR MasterMix（含染料）购自天根生化科技有限公司。PCR反应体积为50 μL，包括DNA模板、Taq PCR MasterMix、上下游引物及蒸馏水。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳鉴定。研究中的FVⅡ和FX引物由上海交通大学医学院附属瑞金医院王学锋教授馈赠（引物具体序列及扩增条件见参考文献[5-6]）。

1.2.5 DNA序列分析：PCR产物原液由上海桑尼生物工程有限公司测序，用Chromas软件将测序结果与美国NCBI基因库所公布的FVⅡ序列（J02933）和FX序列（AF503510）进行比对，寻找相应的基因突变位点，并且突变序列再经反向测序证实。针对新突变位点，用PCR扩增结合DNA直接测序法筛查106例健康对照组来排除多态性。

2 结果

2.1 患者实验室表型指标的变化 遗传性FVⅡ与FX联合缺陷患者误食敌鼠钠后，治疗前实验室检查首次结果PT、APTT明显延长，分别为102.4 s和88.5 s，FⅡ∶C、FVⅡ∶C、FIX∶C、FX∶C分别为7%、3%、8%和2%。在1年多治疗期间多次复查PT、APTT仍明显延长，FVⅡ、FX促凝活性为5%左右，而FⅡ、FIX促凝活性在治疗1周后逐渐回升，12周后基本维持在正常水平。患者其他凝血指标FIB、FV∶C均在正常值范围内，见表1。

2.2 患者治疗稳定后及家庭成员的主要实验室检测结果 患者经1年多的维生素K及相关治疗后FVⅡ∶Ag和FX∶Ag分别为7%和30%；父亲、母亲、姐姐的PT稍延长，FVⅡ∶C、FX∶C、FX∶Ag稍减低或正常，APTT、FIB、FVⅡ∶Ag、FⅡ∶C、FV∶C、FIX∶C均在正常值范围内。见表2。

2.3 患者及家庭成员F7和F10基因分析结果 患者F7基因分析g.11267C＞T的纯合突变导致Arg277Cys，F10基因g.28139G＞T的纯合突变导致Val384Phe，其父亲、母亲、姐姐均存在F7基因g.11267C＞T和F10基因g.28139G＞T杂合子，见表3及图1。F7基因Arg277Cys突变及F10基因Val384Phe突变均经反向测序证实，并通过筛查健康对照组，除外基因多态性的存在可能，并经测序验证了患者F7基因及F10基因的其他外显子及侧翼序列均未发现其他的突变。

表1 患者实验室表型指标的变化结果

表2 患者及家庭成员主要实验室检查结果

表3 患者及家庭成员基因测序结果

图1 患者及对照组F7基因和F10基因相应位点的测序图

3 讨论

凝血因子VⅡ和X是维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶，与其他丝氨酸蛋白酶具有相似的丝氨酸蛋白酶结构域，在凝血过程中发挥重要作用。FVⅡ（a）与TF一起参与外源性凝血途径的启动和凝血过程。FX可以被内源凝血途径FIXa/FVⅢa/Ca2+/磷脂酰丝氨酸（PF3）复合物或外源凝血途径FVⅡa/TF/Ca2+复合物激活，FXa与FVa、Ca2+、PF3形成凝血酶原酶复合物，激活凝血酶原为凝血酶，促进凝血酶的生成。遗传性FVⅡ与FX联合缺乏会严重影响正常凝血功能，实验室检查可表现为PT、APTT明显延长，FVⅡ∶C与FX∶C明显减低。

敌鼠钠盐又名双苯杀鼠酮钠盐，化学名为2-（二甲基乙酰基）-1，3-茚满二酮钠盐（C23H16O3Na），是淡黄色固体粉末，误服0.25 g就可产生中毒症状，该药进入人体后干扰肝脏对维生素K的利用，抑制肝脏合成维生素K依赖的FⅡ、FVⅡ、FIX、FX，影响凝血活酶及凝血酶原酶的合成，使凝血时间延长导致出血；破坏毛细血管壁，使血管通透性显著增加[4]。敌鼠钠盐中毒后实验室检查可表现为PT、APTT延长，FⅡ∶C、FVⅡ∶C、FIX∶C、FX∶C减低[7]。因此，遗传性FVⅡ与FX联合缺乏症与获得性维生素K缺乏症[8]的实验室检查非常相似。本研究患者误食伴有敌鼠钠的食物来院就诊，根据病史、临床表现和实验室检查特点初步诊断为“老鼠药中毒”，予以维生素K等治疗。

本研究患者误食敌鼠钠后反复使用维生素K或凝血酶原复合物治疗1年多，期间多次复查PT、APTT明显延长，FVⅡ∶C和FX∶C仍维持在低水平没有改善，而FⅡ∶C、FIX∶C在治疗1周后逐渐回升，12周后基本维持在正常水平。为排除是否存在先天性因子的缺陷，征求家属同意后分析患者家庭成员的F7基因和F10基因，发现患者存在F7基因Arg277Cys纯合突变和F10基因Val384Phe纯合突变，且遗传自具有相应杂合突变位点的父亲和母亲。因此，该患者经治疗后FVⅡ∶C和FX∶C仍明显偏低是由于遗传性FVⅡ与FX联合缺陷所致。

遗传性FVⅡ和FX缺陷症是单基因疾病，主要由基因突变所致，其临床表现存在异质性[9-11]，表现为因子抗原含量在不同先证者之间可以从＜1%到基本正常，且其在携带有杂合子的不同家系成员间具有更大的异质性；临床出血严重程度在不同先证者间可以从无出血史到明显出血史等。本研究患者平素无明显出血史，治疗后若无明显临床出血表现，视具体情况可停止相应的治疗，减轻患者的经济负担和减少药物不良反应的影响。

综上所述，遗传性FVⅡ与FX联合缺陷症的实验室检查特点与获得性维生素K缺乏症极其相似，容易导致误诊和漏诊。凝血因子基因分析是诊断先天性凝血因子缺陷的有效方法。

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（本文编辑：吴健敏）

Phenotype change and correlative analysis for a combined inherited factor VII and factor X deficiency due to accidental ingestion of a diphacinone rodenticide

XIE Yaosheng, JIN Yanhui, XIE Haixiao, YANG Lihong,ZHU Liqing, WANG Mingshan. Laboratory Medicine Center, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To explore the characteristics of laboratory phenotype and correlative analysis for a patient with combined inherited FVII and FX deficiency after he had ate a diphacinone rodenticide accidentally. Methods: The coagulant parameter screening tests and coagulation factors activities were detected for many times in the patient due to accidental ingestion of a diphacinone rodenticide. After the patient was treated for more than one year, gene analysis of correlated coagulation factors was analyzed in the patient and other family members with DNA direct sequencing. Select 106 persons of health examination as control. Results: After the patient was admitted to hospital, routine coagulation screening tests revealed the prolonged prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) and low levels of vitamin K-dependent coagulation factors (FII, FVII, FIX, FX) activity, which was 102.4 s, 88.5 s, 7%, 3%, 8% and 2%, respectively. During more than one year of treatment, the value of PT and APTT still showed significantly prolonged, FVII and FX activity levels were about 5%. While FII and FIX activity levels were in the normal range after 12 weeks of treatment. Two homozygous mutations, g.11267C＞T of F7 gene resulting in the substitution Arg277Cys and g.28139G＞T of F10 gene leading to the substitution Val384Phe, were identified in the patient. The patient’s parents and sister were heterozygous for Arg277Cys and Val384Phe mutations. FVII and FX antigen levels in the patient were 7% and 30%, respectively. Conclusion: There are many similarities in the characteristics of laboratory examination between combined inherited FVII and FX deficiency and acquired vitamin K deficiency. The best way to identify them is gene analysis.

FVII deficiency; FX deficiency; mutation; coagulation disorder; intoxication

R394.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.006

2015-03-16

温州市科技局科研基金资助项目（Y20100284）。

谢耀盛（1978-），男，浙江温州人，主管技师。

王明山，主任技师，硕士生导师，Email：wywms@126.com。