辣椒枯萎病拮抗细菌Ljb002菌株发酵条件的优化

吴 月, 李海群, 乔 雪, 姜治民, 孙军德*

(1.沈阳农业大学 土地与环境学院，辽宁 沈阳 110161；2.沈阳生物技术研究所，辽宁 沈阳 110034)



辣椒枯萎病拮抗细菌Ljb002菌株发酵条件的优化

吴 月1, 李海群2, 乔 雪1, 姜治民2, 孙军德1*

(1.沈阳农业大学 土地与环境学院，辽宁 沈阳 110161；2.沈阳生物技术研究所，辽宁 沈阳 110034)

从辣椒根际分离筛选到1株具有较强促生能力但拮抗能力一般的细菌菌株Ljb002，为提高抑制辣椒枯萎病病原菌孢子的萌发能力，采用响应面分析方法(Response Surface Methodology，RSM)对该菌株的液体发酵条件进行优化。在单因素的基础上利用Plackett-Burman设计方法对8种影响因素进行了重要性评价。结果表明，初始pH、蛋白胨和MgSO4加入量对菌株Ljb002发酵液抑制孢子萌发的能力有显著影响。采用响应面分析方法对这3个主要因素进行优化，优化的最佳条件组成为初始pH 7.72、蛋白胨12.93 g/L、硫酸镁1.98 g/L、葡萄糖20 g/L、接种量3%、种龄10 h、100 mL三角瓶装液量为14 mL、培养温度28 ℃，此时相对孢子萌发抑制率最大为96.73%。在验证试验中相对孢子萌发抑制率达到了95.18%，与优化前相对孢子萌发抑制率64.37%相比提高了32.37%。

生物防治；响应面分析方法；尖孢镰刀菌；相对孢子萌发抑制率

辣椒枯萎病是一种由尖孢镰刀菌辣椒专化型(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum(Atk.) Synder et Hansen)引起的维管束疾病，初期植株下部叶片大量脱落，与地面接触的茎基部皮层呈水浸状腐烂，地上部茎叶迅速凋萎，有时病部只在茎的一侧发展，形成纵向条状坏死区，后期全部枯死[1]。该病在我国陕西、甘肃、四川、吉林等地均有发生，发病率一般为15%～30%，严重时达70%～80%，有的甚至全田枯萎死亡，成为辣椒生产的一个重要病害[2]。Placket-Burman (P-B)试验是近年来研究者们普遍采用的实验设计方法[3-6]，响应面优化法是20世纪90年代初从西方兴起的一种试验统计方法，通过对方程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制，可方便地求出相应于各因素水平的响应值[7-8]。菌株Ljb002是从辣椒根际分离出来的一株细菌，平板对峙试验以及无菌植株活体抗病试验表明该菌株具有较强的促进根系生长的能力，但是抑制辣椒枯萎病病原菌的能力一般。因此，本文以获得较高的辣椒枯萎病病原菌孢子的相对萌发抑制率为目的，采用P-B设计法以及响应面设计法优化Ljb002的发酵条件，进而获得使Ljb002具有促生和拮抗能力双优的发酵条件，为生物农药和生物肥料的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 从辣椒根际分离筛选得到的Ljb002菌株以及辣椒枯萎病病原菌均保存于沈阳农业大学微生物教研室。

1.1.2 培养基(质量分数，%) ①马铃薯PD液体培养基：马铃薯20，葡萄糖2，pH自然; ②基础种子培养基：牛肉膏0.32，蛋白胨1，NaCl l.5，pH 7.0; ③Placket-Burman实验优化培养基：按实验设计配置。

1.2 方法

1.2.1 种子培养 将Ljb002菌株接种到装有100 mL基础种子培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、120 r/min摇床培养12 h。

1.2.2 P-B实验设计 通过单因素实验设计依次对碳源(麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、糊精)、碳源浓度、氮源(牛肉膏、尿素、硝酸钠、酵母浸粉、氯化铵、蛋白胨)、氮源浓度、无机盐(ZnSO4·7H2O、NaCl、MgSO4、K2HPO4·3H2O、FeSO4、CaSO4)、无机盐浓度、初始pH、种龄、发酵温度、装液量等因素进行优化，采用在固定前一个因素的情况下对下一个因素进行优化的方法以获得最优的发酵条件。在单因素的基础上采用P-B设计方法进行设计，每个因素使用高、低2个水平,分别记为1、-1，并且设定高水平为低水平的1.5倍，各因子水平见表1。利用SPSS软件对以上各因素进行重要性评价，显著性位于前三的单因素进行随后的响应面设计。

1.2.3 响应面(RSM)实验设计 在筛选出影响显著的因素后，以显著因素为自变量，以相对孢子萌发抑制率为响应值采用3因素3水平17组实验做响应面设计，以确定最佳的发酵条件，各个因素水平见表2。

1.2.4 发酵液活性检测方法 将Ljb002菌株发酵液离心(8 000 r/min、4 ℃、30 min)，收集上清液待用。1 mL辣椒枯萎病病原菌孢子悬液(1×108个/mL)、1 mL细菌发酵上清液以及0.5 mL PD培养液混合，120 r/min、28 ℃震荡5.5 h，采用血球计数板法对孢子萌发情况进行测定，相对孢子萌发抑制率的计算公式如下：

其中Dck为无菌水代替菌株发酵上清液时萌发的孢子数；Dt为正常处理下孢子萌发数。

表1 P-B试验设计因素水平

注：因素编号下表同

表2 RSM实验设计因子水平

2 结果与分析

2.1 发酵条件关键性因素的确定

在单因素的基础上根据P-B设计方法以及SPSS软件考察了8种因素对辣椒枯萎病病原菌孢子萌发的影响，结果见表3、表4。

表3 P-B试验设计结果(N=12)

表4 各因素效应及重要性评价

根据SPSS处理结果可知，8个因素中影响显著性顺序为初始pH>MgSO4>蛋白胨>种龄>装液量>葡萄糖>接种量>温度，因此蛋白胨、初始pH、MgSO4对病原菌孢子萌发的抑制率存在较显著的影响，确定其为下一步的关键因素。

2.2 响应面(RSM)实验设计法优化发酵因素

采用Design-Expert 8.0软件进行各个因素间的交互作用对相对孢子萌发抑制率的响应面分析。结果见表5、表6。

表5 RSM试验设计及结果(N=17)

表6 二次多项模型及各项的方差分析表

图1 初始pH和蛋白胨对相对孢子萌发抑制率的模型方程等高线图(a)和响应面立体分析图(b)Fig.1 Contour plots (a)and response surface stereo analysis diagram (b) of regression eqation of initial pH vs peptone concentration and relative spore germination inhibition rate

图2 初始pH和MgSO4对相对孢子萌发抑制率的等高线图(a)和响应面立体分析图(b)Fig.2 Contour plots (a) and response surface stereo analysis diagram (b) of regression eqation of initial pH vs MgSO4 concentration and relative spore germination inhibition rate

响应面图形是特定的响应值Y对应的因素X2、X3、X8构成的三维空间在二维平面上的等高线图，可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响[9]。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[10]。从响应面分析图1～3可知，蛋白胨、初始pH、MgSO4对相对孢子萌发抑制率的影响显著，这与方差分析中的显著性分析结果相同。

为进一步确定使相对孢子萌发抑制率达到最大的最佳因素配比，通过Design-Expert软件以相对孢子萌发抑制率最大值为目标，优化了最终发酵条件，初始pH为7.72、蛋白胨含量为12.93 g/L、MgSO4含量为1.98 g/L，此时相对孢子萌发抑制率最大为96.73%。在此优化的培养条件下进行5组平行验证试验，所得相对孢子萌发抑制率为95.18%，与所得的预测值相近，与优化前相对孢子萌发抑制率64.37%相比提高了32.37%。

图3 蛋白胨和MgSO4对相对孢子萌发抑制率的等高线图(a)和响应面立体分析图(b)Fig.3 Contour plots and response surface stereo analysis diagram of regression equation of peptone concentration vs MgSO4 concentration and relative spore germination inhibition rate

3 讨 论

采用Design-Expert 8.0软件进行优化设计，通过P-B试验确定了3种对于相对孢子萌发抑制率影响显著的因子，即初始pH、蛋白胨和MgSO4，通过响应面设计实验得到了该3种影响因子与相对孢子萌发抑制率关系的回归模型，经验证该回归模型是可靠的。同时利用响应面三维图以及等高线图分析了3种影响因子及其交互作用对于相对孢子萌发抑制率的影响，得到了最优的发酵条件，进一步试验验证表明，采用响应面分析法对生防菌发酵工艺进行优化是非常有效的[11]。

经过优化后的发酵条件为初始pH 7.72、蛋白胨12.93 g/L、MgSO41.98 g/L、葡萄糖20 g/L、接种量3%、种龄10 h、100 mL三角瓶的装液量为14 mL、培养温度28 ℃，此时相对孢子萌发抑制率最高为95.18%。该研究结果为生防制剂的研制提供了一定的参考。

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Optimization of Ferment Conditions of Pepper Wilt Antagonistic Bacterium Strain Ljb002

WU Yue1, LI Hai-qun2, QIAO Xue1, JIANG Zhi-min2, SUN Jun-de1

(1.Coll.Land&Env.,ShenyangAgric.Uni.Shenyang110161; 2.ShenyangInst.Biotech.,Shenyang110034)

Ljb002 was screened from pepper rhizosphere with a high growth-promotion ability but normal inhibition ability against pepper wilt pathogen (Fusariumoxysporium) spore germination. In order to improve inhibition ability of Ljb002, response surface methodology (RSM) was used to optimize the ferment condition. Based on single factor, Plackett-Burman (PB) designing method was used to evaluate the importance of 8 influence factors. The results indicated that initial pH, concentration of peptone and MgSO4had significant influence on the inhibition ability ofF.oxysporiumspore germination. Response surface methodology (RSM) was used to optimize these 3 main factors and the optimized compositions were initial pH 7.72, peptone 12.93 g/L, MgSO41.98 g/L, glucose 20 g/L, inoculum volume 3%, seed age 10 h, 14 mL of medium solution in 100 mL flask, temperature 28 ℃. At this time, the highest relative spore germination inhibit rate was 96.73%. In the verification experiment, the relative spore germination inhibition rate was 95.18%, rise by 32.37% higher as compared with the one before the optimized one (64.37%).

bio-control; response surface methodology (RSM); pepper wilt (Fusariumoxysporium); relative spore germination inhibition rate

沈阳市科学技术局项目(20141224)

吴月 女，硕士研究生。研究方向为应用微生物。E-mail：wuyuesw@163.com

* 通讯作者。男，教授，博士生导师。研究方向为应用微生物。E-mail：sunjunde108@163.com

2014-12-22；

2015-02-23

Q93-335

A

1005-7021(2015)05-0067-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.012