采用析因设计研究瑞氏-吉姆萨染色法的影响因素

孟 凡，靳宏辉

采用析因设计研究瑞氏-吉姆萨染色法的影响因素

孟 凡，靳宏辉

目的：探讨离子强度和温度对瑞氏-吉姆萨（Wright-Giemsa）染色法的影响。方法：采用两因素三水平析因设计方法，分别探讨磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的3个水平对染色效果的影响，选出较优的浓度，并通过实验找到瑞氏染液的最适合温度。结果：稀释20倍的A工作液与稀释20倍的B工作液（即A1B1组合）的染色效果优于其他组合，实验温度在32～36℃时，染色效果较佳。结论：采用实验修改后的瑞吉染色配方和染色条件做血片染色、血液细胞浆染色，颗粒特征明显，细胞核染色质结构清晰，值得在医院血液实验室推广使用。

瑞氏-吉姆萨染色；析因设计；磷酸氢二钠；磷酸二氢钾；离子强度；温度

0 引言

为了观察细胞的内部结构（胞质内的颗粒、细胞核、染色质等），识别各种细胞的正常及异常变化，对血涂片及骨髓片等要进行染色，目前临床检验中最常用的是瑞氏染色法，甚至为了提高细胞核及寄生虫的染色效果，将瑞氏染液与吉姆萨染液联用即瑞氏-吉姆萨（Wright Giemsa）染色）[1]。影响瑞氏染色的因素很多，染色的好坏与染色液、缓冲液的质量及比例、加液间隔时间、保持玻片染色液面的张力等染色技巧均有重大关系[2-3]。为了提高染色效果、探讨最优染色条件、达到正确识别细胞和鉴别细胞，我们重点研究缓冲液的离子强度、实验温度对染色的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本

随机选取当日门诊血常规标本。

1.1.2 仪器

TL型电热恒温水浴箱（姜堰市天力医疗器械有限公司，型号600-AB）、电子天平（上海精密化仪器科学有限公司，型号JY4001）。

1.1.3 试剂

磷酸二氢钾（成都市科龙化工试剂厂，分子量136.09，批号20101201）、磷酸氢二钠（成都市科龙化工试剂厂，分子量358.14，批号20101123）、蒸馏水、瑞氏染液1液。

1.1.4 器材

100和500 ml量筒、5 ml移液管、1 000 ml容量瓶、洗耳球、染色缸、pH试纸（上海三爱思试剂有限公司，批号20100805）、载玻片、毛细管。

1.1.5 标本制备

（1）用毛细管在距载玻片一端1 cm处加一滴（约0.05 ml）EDTA抗凝全血，左手执载玻片，右手持推片接近血滴，使血液沿推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载玻片呈30～45°角，匀速将血液推成厚薄适宜的血涂片，血涂片应厚薄适宜、分布均匀、头体尾明显、边缘整齐，两边留有一定的空隙。

（2）在载玻片的一端用记号笔编号。（3）待自然干燥后备用。

1.1.6 试剂准备

用电子天平准确称取磷酸氢二钠4 g（A工作液）、磷酸二氢钾6 g（B工作液）于容量瓶中，加新鲜蒸馏水至1 000 ml并搅拌至其溶解，混匀待用。

1.2 实验方法

1.2.1 磷酸氢二钠与磷酸二氢钾两因素三水平（2× 3）析因设计

设定磷酸氢二钠为A，磷酸二氢钾为B，其各自有3个实验水平，分别为A1、A2、A3，B1、B2、B3，则其实验模型见表1。

表1 AB（2×3）析因设计实验模型

按照此模型，取相应量的各试剂配制成相应的实验组合，再加用新鲜蒸馏水做对照（溶液编号：10）。AB（2×3）析因设计实验流程见表2。

表2 AB（2×3）析因设计实验流程

1.2.2 染色

将染液1液（瑞氏染料）装入染色缸中，放入36℃恒温水浴箱中，染液2液（缓冲液）同1液的操作步骤，待二者的温度均保持在36℃时，将血涂片放入1液池45 s后再放入2液池，染色90 s后取出，待自然干燥后镜检观察结果。

1.2.3 结果

离子强度对染色影响实验结果见表3。

表3 离子强度对染色影响实验结果

图1 A1B1组合

图2 A2B2组合

图3 A3B3组合

1.2.4 研究实验温度对染色结果的影响

（1）取A1B1浓度的磷酸氢二钠与磷酸二氢钾装入染色缸中，置于26℃的水浴箱中，其余染色步骤同1.2.2。

（2）取A1B1浓度的磷酸氢二钠与磷酸二氢钾装入染色缸中，置于28℃的水浴箱中，其余染色步骤同1.1.2。

（3）取A1B1浓度的磷酸氢二钠与磷酸二氢钾装入染色缸中，置于30℃的水浴箱中，其余染色步骤同1.1.2。

（4）取A1B1浓度的磷酸氢二钠与磷酸二氢钾装入染色缸中，置于32℃的水浴箱中，其余染色步骤同1.1.2。

（5）取A1B1浓度的磷酸氢二钠与磷酸二氢钾装入染色缸中，置于36℃的水浴箱中，其余染色步骤同1.1.2。

（6）取A1B1浓度的磷酸氢二钠与磷酸二氢钾装入染色缸中，置于40℃的水浴箱中，其余染色步骤同1.1.2。

1.2.5 结果

温度对染色影响实验结果见表4。

表4 温度对染色影响实验结果

图4 36℃染色效果（最好）

图5 40℃染色效果（欠佳）

2 结果

实验发现：原工作液的浓度较大，染色效果较差，有核细胞的细胞核着色不良，颗粒模糊不清，稀释20倍的A工作液与稀释20倍的B工作液（即A1B1组合）的染色效果优于其他组合。实验温度在32～ 36℃时，染色效果较佳，温度较低时，有核细胞着色不良，细胞核及颗粒颜色偏浅，模糊不清；当温度过高（大于40℃时），细胞着色偏深，核染色质不清晰。

3 讨论

（1）析因设计方法在现今的科研中得到越来越多的应用。析因设计的最大优点是所获得的信息量很多，可以准确地估计各实验因素的主效应的大小，还可估计因素之间各级交互作用效应的大小[4]，当然也有其缺点，就是所需要的实验次数多，因此耗费的人力、物力和时间也较多。

（2）细胞的主要成分为蛋白质，离子强度会对其有影响，当缓冲液的浓度越大，即离子强度越大时，离子间的相互作用越强，产生的排斥力越大，那么就会降低染料与细胞的结合，同时缓冲液的浓度较低时，还能促使带有电荷的染料渗入细胞内，使其更易着色[5]。

（3）在实验过程中，将pH值对其的影响也进行了简单的探讨，在pH值为6.0～6.8时，得到了不错的染色效果。当pH值＜6.0时，缓冲液越偏酸性，细胞染色越偏红，因为细胞的主要成分属蛋白质，由于蛋白质是两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，当pH小于等电点（isoelectric point，PI）时，蛋白质带正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；当pH值＞6.8时，缓冲液越偏碱性，细胞染色越偏蓝，因为当pH大于PI时，蛋白质所带负电荷增多，易与美蓝或天青B结合，染色偏蓝[6-7]。

（4）将实验设在6个不同的温度中进行，可以看出当实验温度在32～36℃时，细胞的染色效果较佳。在温度较低时，细胞着色不良，当温度过高时，细胞着色较深，因为在浓度一定时，升高温度，反应物分子的能量增加，使一部分原来能量较低的分子变成活化分子，从而增加了反应物分子中活化分子的数量，使有效碰撞的次数增多，因而化学反应速率增快，反之，速率减慢[8]。

（5）为了能使细胞核与寄生虫着色更好，在40ml瑞氏染液中加入0.5 g的吉姆萨染料，用标准浓度的缓冲液，染色步骤同1.2.2。镜检后发现，细胞着色效果较之前无明显改变，然后用瑞氏染液将配制好的瑞吉染液按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8进行稀释，然后同上述染色步骤染色，镜检后发现1∶1的稀释倍数染色效果较佳，表现为：正常成熟红细胞呈粉红色，中性粒细胞颗粒呈淡紫红色，核呈紫红色，嗜酸性颗粒呈橘黄色，嗜碱性颗粒呈暗紫色，单核细胞的胞浆颗粒呈细小淡紫红色，核呈紫红色，淋巴细胞核呈紫红色[9]。

综上所述，通过实验可以看出：当把缓冲液的原液稀释20倍时染色效果较佳；缓冲液的pH值在6.0～6.8时染色效果较佳[10]；实验温度控制在32～36℃时染色效果较佳。通过在瑞氏染液中加入一定量的吉姆萨染料，可以使细胞核染色效果更好，细胞结构更清晰。

4 结语

随着医学事业的快速发展，检验行业不仅需要提高检验效率，更要保证检验质量。通过实验研究影响瑞氏染色的主要因素，并且找出各因素的最佳值，使血涂片和骨髓片的染色效果得到提升，方便对细胞的正确辨别，有助于临床工作的开展。

[1] 胡章达.瑞氏—姬姆萨染色方法改进[J].安庆医学，2000，4（1）：2-5.

[2] 李河.析因实验设计资料的统计学分析[J].循证医学，2005，5（1）：35-38.

[3] 李悦，朱凯，章志红.SPSS实现析因设计资料单独效应分析的四种方法及比较[J].中国卫生统计，2011，28（3）：324-329.

[4] 李新，范颖.三因素析因设计分析黄芪有效部位的交互关系[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（1）：171-175.

[5] 夏克明，周燕.瑞氏染色法中缓冲液浓度对染色结果的影响分析[J].贵州医药，2007，4（5）：3-4.

[6] 蒋竞杭，王铁霞.缓冲液pH值对血涂片Wright′s染色的影响分析[J].卫生职业教育，2006，15（6）：29.

[7] 熊立凡，刘成玉.临床检验基础[M].4版.北京：人民卫生出版社，2007.

[8] 杨承印.化学教学设计与技能实践[M].北京：科学出版社，2007：32.

[9] 许艳英.一种快速瑞氏—姬姆萨染液的配制和应用[J].医学理论与实践，2002，15（7）：828.

[10] 刘志兰，杨彬，赵宝忠.血细胞涂片瑞氏染色法缓冲液的选择[J].临床检验杂志，2011，29（4）：252-253.

（收稿：2014-11-20 修回：2015-03-15）

Research on influence factors of Wright-Giemsa staining method by factorial design

MENG Fan,JIN Hong-hui
(Institution Hospital of Chengdu Military Area Command,Chengdu 610000,China)

ObjectiveTo investigate the influences of ionic strength and temperature on Wright-Giemsa staining method.MethodsThe dyeing effects of three levels of sodium dihydrogen phosphate and potassium hydrogen phosphate were evaluated using two factors and three level factorial design methods for choosing the optimal concentration.A series of experiments were conducted to find the optimum concentration and temperature for Wright's staining.ResultsThe combination of solution A and B diluted for 20 times(A1B1)had better dyeing effects than other combinations,especially when the experimental temperature was from 32 to 36℃.ConclusionDyeing effect can be enhanced by using the modified Wright's staining and recommended temperature above mentioned,which are worthy popularizing and appling in hospital blood laboratory.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（8）：124-126]

Wright's staining method;factorial design;sodium dihydrogen phosphate;potassium hydrogen phosphate;ionic strength;temperature

R318；R197.39

A

1003-8868（2015）08-0124-03

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.08.124

孟 凡（1982—），女，检验师，主要从事血液细胞形态学方面的研究工作。

610000成都，成都军区机关医院（孟 凡，靳宏辉）