HPD大孔树脂纯化白胡椒中胡椒碱*

刘笑，侯顺超，顾林

(扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州，225000)

胡椒(Piper nigrum L)，又名白川、浮椒，是胡椒科胡椒属常绿藤本植物［1］。原产于印度，被称为“热带香料之王”，西汉时期传入我国，如今已成为我国海南的特色产业［2］。根据果实的成熟程度胡椒有黑白之分，白胡椒粒圆个大，质坚味强，呈(灰)白色，手感质地略重，气味不及黑胡椒辛辣［3-4］。虽然白胡椒中挥发油含量及所含的化学成分低于黑胡椒，但在药用价值和临床应用方面，以白胡椒作用较佳［5］，尤其是驱寒除湿、健胃保肝的功效更为显著。胡椒碱是胡椒中主要的生物活性物质，近年来倍受关注，成为保健产品开发的新资源。胡椒碱具有抗炎［6］、抑菌［7-8］、降血脂［9］、抗氧化［10］等活性，对白癜风［11］、抑郁症［12］、心肌缺血［13］等疾病有一定疗效，更有潜力被开发为新的抗癌药物［14-16］。国内外对于胡椒碱提取方法的研究很多，主要有酸水提取法［17］、有机溶剂浸提法［18-19］、超声波辅助法［20-21］、超临界流体萃取法［22-23］和微波减压蒸馏法［24-25］等，但是所得提取液多为胡椒碱粗提液，杂质较多，需要进一步纯化。

大孔吸附树脂广泛用于黄酮类、多酚类、生物碱等活性成分的分离纯化［26-28］，具有快速、高效、选择性强、可再生等优点。目前仅有采用HPD 800、H 103大孔树脂纯化胡椒碱的报道［29-30］。本文选用HPD系列5种不同极性的大孔树脂对白胡椒中胡椒碱提取物进行吸附解析，从中筛选出较为合适的树脂类型进行胡椒碱的纯化工艺研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白胡椒，海南儋州市;胡椒碱标准品(98%)，天津一方科技有限公司;无水乙醇(分析纯)，上海苏懿化学试剂有限公司;HPD系列大孔树脂，河北沧州宝恩化工有限公司产品。

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;SHZ-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司;HL-2S恒流泵、DBS-100电脑全自动部份收集器，上海青浦沪西仪器厂;紫外分光光度计，上海欣茂仪器有限公司;KQ-200KDE型高功率数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 胡椒碱粗提液的制备［31］

称取适量白胡椒置于50℃烘箱中恒温干燥48 h，粉碎并过100目筛，得到白胡椒粉备用。将白胡椒粉和无水乙醇按料液比1∶20(g∶mL)加入250 mL锥形瓶中浸泡，暗处静置1 h，超声提取后抽滤得到滤液，即为胡椒碱提取液。

1.3.2 标准曲线的制备

准确称取15 mg胡椒碱标品，无水乙醇定容至100 mL，分别取200、400、600、800、1 000、1 200、1 400 μL于25 mL容量瓶中，无水乙醇定容，得到浓度分别为 1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4 μg/mL 的胡椒碱醇溶液，以无水乙醇作参比，于波长342 nm处测吸光度，绘制标准曲线，如图1所示。

图1 胡椒碱吸光度标准曲线Fig.1 piperine absorbance standard curve

稀释至一定倍数的提取液于波长342nm处测吸光度，根据标准曲线方程计算出胡椒碱质量浓度。

1.3.3 静态吸附与解析

1.3.3.1 树脂类型对胡椒碱静态吸附-解析的影响

根据胡椒碱的理化特性和大孔树脂的吸附性能，选用 HPD 100、HPD 400、HPD 722、HPD 750、HPD 950五种大孔树脂进行试验。分别称取4 g预处理好的树脂(湿重)置于100 mL锥形瓶中，加入1.94 mg/mL的胡椒碱原液30 mL，常温下避光吸附12 h，测定吸附后胡椒碱溶液的质量浓度。分别向滤出的树脂中加入30 mL pH 3的无水乙醇，30℃避光解析12 h，测定解析后溶液中胡椒碱质量浓度，计算吸附率、解析率和胡椒碱得率。

c0:胡椒碱原液的质量浓度，mg/mL;c1:吸附后胡椒碱的质量浓度，mg/mL;c2:解析后溶液中胡椒碱的质量浓度，mg/mL;m:树脂质量，g;V:原液体积，mL。

1.3.3.2 原液质量浓度对胡椒碱静态吸附的影响

称取4 g预处理好的树脂(湿重)置于100 mL锥形瓶中，分别加入30 mL质量浓度为1.5、1.9、2.2、2.6、3.0、3.4、3.8 mg/mL 的胡椒碱原液，常温下避光吸附5 h，测定吸附后胡椒碱溶液的质量浓度，计算吸附率和吸附量。

1.3.3.3 解析液乙醇体积分数对胡椒碱静态解析的影响

预处理好的树脂(湿重)中加入一定量2.6 mg/mL的胡椒碱原液，常温下避光吸附5 h，测定吸附后胡椒碱溶液的质量浓度。称取5份4 g滤出的树脂，分别加入30 mL pH 3体积分数为20%、40%、60%、80%、95%、100%的乙醇，30℃避光解析5 h，测定解析后溶液中胡椒碱质量浓度，计算解析率。

1.3.4 动态吸附与解析

1.3.4.1 上柱液流速对胡椒碱动态吸附的影响

选用Φ1.6 cm ×50 cm的玻璃层析柱，称取35 g HPD 722大孔树脂，湿法装柱，有效柱高约25 cm。调节恒流泵，使质量浓度为2.6 mg/mL的胡椒碱原液分别以1、3、6 mL/min的流速进样，每5 mL收集一管，测定试管中胡椒碱浓度，计算吸附率。

1.3.4.2 HPD 722树脂动态解析胡椒碱

质量浓度为2.6 mg/mL的胡椒碱原液以3 mL/min的流速进样，HPD 722树脂充分吸附后，用pH 3的无水乙醇洗脱，每5或10 mL收集一管，测定试管中胡椒碱浓度，计算解析率。

2 结果与分析

2.1 静态吸附与解析

2.1.1 树脂类型对胡椒碱静态吸附-解析的影响

由表1可知，HPD系列不同极性的树脂对胡椒碱的吸附-解析效果不同。试验中HPD 950的吸附率最高，但解析率很低，故其胡椒碱得率最低;而HPD 722、HPD 100和HPD 750的得率相对较高，这可能是由于胡椒碱属于弱碱性物质，但又有一定的极性和亲水性，有利于某些弱极性或非极性树脂的吸附，故对这3种树脂作进一步比较，试验结果见图2和图3。

表1 不同树脂对胡椒碱静态吸附-解析效果的影响Table 1 Adsorption and desorption capabilities of different macroporous resins to piperine

由图2可知，胡椒碱吸附率随着吸附时间的延长而增大，当吸附时间超过5 h后，HPD 100和 HPD 722吸附率逐渐达到饱和，分别为52.157%和53.019%，HPD 750的吸附率在吸附3 h后达到最大值43.012%。由图3可知，1～5h内解析率逐渐增加，此后再延长解析时间，解析率几乎无变化。虽然HPD 750解析率高达82.155%，但其解析率最低，综合考虑吸附率和解析率2个参数，本试验选用HPD 722大孔树脂对胡椒碱进行纯化，且静态解析和吸附的时间均采用5 h。

图2 三种树脂静态吸附动力学曲线Fig.2 Static adsorption kinetic curves of 3 types of macroporous resins

图3 三种树脂静态解析动力学曲线Fig.3 Static desorption kinetic curves of 3 types of macroporous resins

2.1.2 原液质量浓度对胡椒碱静态吸附的影响

由图4可知，树脂吸附效率随着胡椒碱原液质量浓度的增加而增大，当浓度为2.6 mg/mL时，吸附率达到最大，53.332%。此后再增加浓度，吸附率明显降低。同样树脂的吸附量随着原液浓度的增加而增大，当浓度超过2.6 mg/mL后，吸附率的增加幅度明显减小。这可能是因为大孔树脂吸附为物理吸附，随着原液质量浓度的提高，树脂吸附的杂质量也有所增加，对胡椒碱的吸附量趋于饱和甚至下降，同时还会产生多层吸附，导致树脂微孔堵塞，降低内孔的利用度，导致吸附率降低。综上所述，试验选取胡椒碱原液的质量浓度为2.6 mg/mL。

图4 胡椒碱质量浓度对静态吸附的影响Fig.4 Effect of concentration of piperine on static adsorption

2.1.3 解析液乙醇体积分数对胡椒碱静态解析影响

由图5可以看出，随着乙醇体积分数的增加，胡椒碱的解析率也显著增加，说明乙醇浓度对解析的影响很大，这可能是因为胡椒碱易溶于乙醇，故试验选用无水乙醇进行解析。

图5 乙醇体积分数对静态解析的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on static desorption

2.2 动态吸附与解析

2.2.1 上柱液流速对胡椒碱动态吸附的影响

由图6可知，上柱液流速为6 mL/min时，吸附效率最低，这可能是由于流速过快，树脂与胡椒碱分子不能充分接触，胡椒碱直接随着上柱液流出层析柱，从而损失较大。考虑到流速过小，吸附时间较长，故选用3 mL/min为上柱液流速。

2.2.2 HPD 722树脂动态解析曲线

图7为HPD 722树脂动态解析胡椒碱曲线。由图7可知，洗脱液中胡椒碱浓度随着解析液体积的增加而增大，当体积达到50 mL时，胡椒碱含量达到最大值，之后逐渐减少，当体积为200 mL时，洗脱液中胡椒碱含量几乎为0。故选用洗脱液体积200 mL。

图7 动态解析曲线Fig.7 Dynamic desorption curves of piperine

质量浓度为2.6 mg/mL的胡椒碱原液以3 mL/min的流速上样110 mL，HPD 722树脂充分吸附后，用200 mL、pH 3的无水乙醇进行洗脱，重复3次平行试验。结果显示，吸附率53.059%，解析率69.012%，胡椒碱得率36.617%。

3 结论

本实验对HPD系列5种型号的大孔树脂进行筛选，选用HPD 722大孔树脂纯化胡椒碱。通过考察胡椒碱原液质量浓度、解析液乙醇体积分数及上柱液流速对静态和动态纯化效果的影响，初步确定胡椒碱的吸附-解析条件为:上柱液胡椒碱质量浓度2.6 mg/mL，流速3 mL/min，上样体积 110 mL，HPD 722 树脂充分吸附后，pH 3无水乙醇洗脱，洗脱液体积200 mL。此条件下，吸附率53.059%，解析率69.012%，胡椒碱得率可达36.617%。HPD 722大孔树脂对胡椒碱有较好的纯化效果，选择性好，效率高，操作简单且无毒害作用。

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