V1C定点突变木聚糖酶XynZF-2对酶热稳定性的影响*

李同彪，周晨妍，朱新术，王丹丹，2，陈亚文，谢晶晶

1(新乡医学院 生命科学技术学院，河南新乡，453000)

2(新乡医学院三全学院，河南 新乡，453000)

木聚糖是植物细胞组织中半纤维素的重要成分，是一种含量丰富的生物资源。然而在自然界中很难被降解利用，造成了大量生物资源的浪费［1］。木聚糖酶(EC.3.2.1.8)是一类降解木聚糖的多功能酶类的总称［2］，可以将木聚糖水解成低聚木糖、木糖等还原性糖［3］。木聚糖酶在自然界中含量丰富，许多真菌、植物组织、细菌都可产生木聚糖酶，近年来得到了人们的广泛关注［4］。

同时，木聚糖酶也是一种重要的工业酶制剂，广泛应用于食品加工、纺织、纸浆漂白、酿造、饲料加工等多个领域［5］。但不同领域需要的木聚糖酶的特性不同，如纸浆漂白、饲料加工等都需要经过高温处理，而大多数木聚糖酶属于中温木聚糖酶，热稳定性较差，难以满足工业的需求［6］。因此，提高木聚糖酶热稳定性已成为当今人们广泛关注的热点。高树娟等［7］将源于米曲霉 Aspergillus oryzae的木聚糖酶AoXyn11A的N端替换成耐热木聚糖酶EvXyn11TS的相应片段，构建重组木聚糖酶AEx11A，并在毕赤酵母GS115中表达，重组木聚糖酶热稳定性明显提高。DING 等［8］对 Streptomyces lividans的木聚糖酶XynA进行了分子动力学模拟，删除XynA基因的N端，最适温度下降了6℃，删除XynA基因的C端，最适温度增加了6℃。由此推测，木聚糖酶的N端和C端对其热稳定性均有影响。

本实验室已采用RT-PCR等技术，从黑曲霉XZ-3S中克隆出木聚糖酶基因xynZF-2，并在大肠杆菌中实现了异源表达［9］。本研究旨在保持木聚糖酶XynZF-2良好特性的基础上，借助生物信息学分析，采用分子生物学技术，对木聚糖酶XynZF-2进行定点突变，期望提高该酶的热稳定性，为其进一步结构与功能研究提供实验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种和质粒:黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S由本实验室保存;大肠杆菌JM109、BL21(DE3)、表达质粒pET-28a均购自 Novagen公司。重组质粒 pET-28a-xynZF-2由本实验室构建并保存，TA克隆载体pMDTM18-T购自TaKaRa公司。

1.2 培养基、工具酶和主要试剂

培养基:大肠杆菌培养基LB。

工具酶:T4DNA Ligase、限制性内切酶、DL1000 DNA Marker、IPTG以及 X-gal均购自 TaKaRa公司;蛋白分子量标准购自碧云天生物技术有限公司;DNA片段回收试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术公司;DNA质粒提取试剂盒购自Sangon公司;其他生化试剂主要是国产或进口分析纯。

1.3 同源序列比对以及同源建模

通过Blast比对同源序列，并在SWISS-MODEL上完成对XynZF-2V1C的建模［10］。

1.4 定点突变和重组质粒pMDTM18-T-xynZF-2v1c构建

以pET-28a-xynZF-2为模板，采用降落PCR法，反应条件参照文献［9］，引物见表1，扩增出突变基因v1c(图1)，割胶回收。T4DNA Ligase连接胶回收产物与pMDTM18-T载体，16℃过夜。热激转化大肠杆菌JM109，蓝白斑筛选阳性克隆，抽提重组质粒，经PCR验证，送北京六合华大基因公司测序。

表1 定点突变所用引物Table 1 The primers of site-directed mutagenesis

图1 PCR扩增突变基因Fig.1 PCR amplification of the mutant gene

1.5 重组表达载体pET-28a-xynZF-2v1c构建

用EcoRⅠ、HindⅢ限制性内切酶双酶切突变基因v1c和空质粒pET-28a，反应条件37℃、3h，酶切产物电泳，切胶回收。T4 DNA Ligase连接以上两种双酶切产物，转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含Kan抗性的LB固体培养基，构建重组大肠杆菌BL21-pET-28a-xynZF-2v1c。筛选出阳性单克隆菌落，用于重组木聚糖基因的表达。

1.6 重组木聚糖酶基因xynZF-2和xynZF-2v1c的表达

将过夜培养的重组大肠杆菌BL21-pET-28axynZF-2v1c和 BL21-pET-28a-xynZF-2，以2%的接种量接种于含Kan的30 mL的LB培养基中，37℃，230 r/min培养至A600为0.6时，加入IPTG进行诱导，终浓度为2 mmol/L，37 ℃，230 r/min，诱导培养 2h，离心菌体，将沉淀菌体用10 mL柠檬酸-磷酸二氢钠(pH 4.6)悬浮，并在冰水浴中超声波破碎，10 000 r/min离心10 min，所得上清液即为粗酶液。

1.7 重组木聚糖酶XynZF-2和XynZF-2V1C的纯化

采用镍金属螯合亲和层析柱纯化重组木聚糖酶，通过装柱、平衡、上样、洗涤等步骤，对含有His标签蛋白的原酶和突变酶进行分离纯化。收集洗脱的样品液，即为重组原酶XynZF-2和突变酶XynZF-2V1C。采用5%浓缩胶和15%分离胶，对XynZF-2、XynZF-2V1C进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，具体方法见参考文献［9］。

1.8 重组木聚糖酶活性测定

采用DNS法测定木聚糖酶活性［11］。

酶活力单位(U)定义:将1 mL粗酶液溶于1.5 mL的0.5%桦木木聚糖中，40℃水浴反应15 min，以每分钟产生1 μmol还原糖所需的酶量定义为1个单位。

1.9 重组木聚糖酶酶学性质比较及分析

酶学性质分析纯化后的重组原酶和突变酶，测定最适温度、热稳定性、最适pH以及pH稳定性对木聚糖酶活性的影响［9］。Km及Vmax测定:以不同浓度的木聚糖为底物，分别在各自最适pH以及最适温度下，测定重组原酶XynZF-2以及突变酶XynZF-2V1C酶活性。采用 Lineveaver-Burk法作图，求出Km及Vmax。

2 结果与分析

2.1 重组木聚糖酶同源序列比对分析及突变位点确定

利用Blast比对XynZF-2V1C的同源序列，发现来源于E.coli的11家族的木聚糖酶ENXYN11与XynZF-2V1C同源性较高(58.69%)，并以此为模板在SWISS-MODEL上对 XynZF-2V1C同源建模(图2)，并利用DNAMAN6.0以及DS ViewerPro6.0对氨基酸序列、木聚糖酶XynZF-2V1C结构分析。同时，利用氨基酸结构相似性，将第一个位点的缬氨酸突变为半胱氨酸，缬氨酸半胱氨酸的侧链末端分别为羟基和巯基，末端含有羟基的缬氨酸在水中不解离，而末端含有巯基的半胱氨酸的pKa为8.33，这使得水环境与XynZF-2V1C分子表面的相互作用降低，增加了N端与内部结构的相互作用［12］，使木聚糖酶结构的稳定性得到增强。以此为依据，利用大肠杆菌密码子偏爱性设计引物，扩增突变酶基因v1c。

图2 XynZF-2V1C同源建模Fig.2 Homology modeling of XynZF-2V1C

2.2 重组表达载体构建

利用DNAMAN6.0对突变基因v1c限制性酶切位点分析，发现突变基因v1c不含EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点，对突变基因v1c引入EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点，双酶切，连接质粒 pET-28a，构建重组表达载体(图3)。

图3 重组表达载体pET-28a-xynZF-2v1c的构建Fig.3 The construction of recombinant expression vector pET-28a-xynZF-2v1c

2.3 重组木聚糖酶在大肠杆菌中表达和纯化

将重组质粒转化BL21，构建大肠杆菌工程菌。经IPTG诱导表达，提取粗酶液，对含有His6标签的原酶和突变酶，采用镍金属螯合亲和层析柱法得到纯化的重组木聚糖酶，SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化的木聚糖酶XynZF-2和XynZF-2V1C，由图4可见，原酶XynZF-2和突变酶XynZF-2V1C均在32 kDa处有明显条带，突变酶XynZF-2V1C与原酶XynZF-2相对分子质量一致。

图4 木聚糖酶XynZF-2、XynZF-2V1C的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of XynZF-2 and XynZF-2V1C

2.4 酶学性质比较与分析

2.4.1 最适温度及热稳定性比较分析

以DNS法测定原酶与突变酶最适温度(图5)，原酶XynZF-2最适温度为40℃，而突变酶XynZF-2V1C最适温度为50℃。相比原酶，突变酶最适温度提高了10℃。两种木聚糖酶热稳定性如图6所示，原酶XynZF-2在45℃保温20 min完全丧失活性，而突变酶XynZF-2V1C相对酶活性仍高达45%。且在45℃下的半衰期t45℃1/2，突变酶相对于原酶提高了10 min;在50℃保温5 min，原酶相对酶活性降到了30%，而突变酶相对酶活性为60%左右，可见突变酶XynZF-2V1C相比原酶XynZF-2热稳定性明显改善，表明木聚糖酶XynZF-2蛋白结构中，氨基酸序列第1个位点引入半胱氨酸，改变了酶的构象，增强了N端与内部结构的相互作用，突变酶对温度的敏感性减弱，热稳定性明显改善。

图5 温度对木聚糖酶活性的影响Fig.5 Effect of temperature on xylanase activity

图6 木聚糖酶热稳定性比较Fig.6 Comparison of the thermostability of xylanase

2.4.2 pH对酶活性的影响

对XynZF-2和XynZF-2V1C酸碱性分析发现，2种酶最适 pH均为5.0，没有发生变化(图7)。且XynZF-2和XynZF-2V1C均在pH 5.0～9.0较为稳定，相对酶活性均在50%以上(图8)。可见重组酶XynZF-2第1个位点氨基酸由缬氨酸突变为半胱氨酸基本对该酶的酸碱性没有影响。

图7 pH对木聚糖酶活性的影响Fig.7 Effect of pH on the xylanase activity

图8 木聚糖酶pH的稳定性比较Fig.8 Comparison of the pH stability of xylanase

2.4.3 酶动力学分析

以1～10 mg/mL桦木木聚糖为底物，测定XynZF-2和 XynZF-2V1C酶活性，采用 Lineveaver-Burk法作，计算出XynZF-2和XynZF-2V1C的Km分别9.96和12.4 mg/mL，Vmax分别为 74.63和90.91 U/mg。由此可见，突变酶与原酶相比，Km变小，这使得突变酶XynZF-2V1C与底物的亲和力变小，而Vmax变大，有可能使得突变酶XynZF-2V1C的酶活性得到提高。

3 讨论

随着木聚糖酶工业应用范围的不断扩展，对于木聚糖酶特性的改善引起了人们的广泛关注，尤其是对木聚糖酶热稳定性的提高，逐渐成为人们研究的热点［13］。随着生物技术以及生物信息学的不断发展，对木聚糖酶结构的认识不断深入，在木聚糖酶结构内发现催化结构域、底物结合结构域以及热稳定结构域等［14］。很多研究者通过各种生物技术手段对木聚糖酶热稳定性进行改造，如 Rutchadaporn等［15］用 Arg替代来源于A.niger BCC14405的木聚糖酶的Ser/Thr平面的一些Ser和Thr，热稳定性提高了将近20倍左右。

研究表明，N端氨基酸的改变对木聚糖酶的热稳定性有一定的影响［16］。本研究通过对XynZF-2蛋白结构分析比较以及氨基酸特性研究，将第1个位点的缬氨酸突变为半胱氨酸，这使突变酶XynZF-2V1C相比原酶XynZF-2，最适温度提高了10℃;45℃下的半衰期t1/245℃，突变酶相对于原酶提高了10 min左右，热稳定性大大提高。通过单一氨基酸位点的突变而使木聚糖酶XynZF-2V1C热稳定性大大提高，为木聚糖酶XynZF-2V1C后续研究奠定了基础。

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