果汁DNA提取方法的比较

齐玲倩，刘秀，丁梦璇，李静媛，刘远远，尹建军

(中国食品发酵工业研究院，北京，100015)

果汁是一种重要的饮品，但如今果汁掺假问题日趋严重，如市场上存在着橙汁掺加柑橘汁、西柚汁、胡柚汁，苹果汁掺加梨汁、白葡萄汁，红色浆果汁掺加苹果汁及相互掺加等问题［1-2］。这损害了消费者的利益，阻碍了果汁行业的发展和国际贸易的进行，因此，果汁中水果成分的检测显得尤为重要。

分子生物学技术具有方便、准确、迅速、简洁的特点，能够准确无误地从基因水平分析果汁的品种和来源，其结果为证明果汁的真伪提供了可靠的依据。目前，分子生物学方法在中草药鉴定、肉类鉴别上均有应用，在果汁鉴伪领域亦有广阔的发展空间［1，3-4］。然而，应用分子生物学技术进行果汁鉴伪的关键是高质量DNA提取方法的建立。由于果汁富含多糖、多酚、单宁、色素及一些次生代谢物质，使得DNA提取困难，如多酚类物质能使DNA氧化成棕褐色凝胶状物，多糖类物质能与DNA结合成黏稠的胶状物［5-7］。目前，常见的果汁DNA提取方法有CTAB法、改良试剂盒法、改良 CTAB 法等［8-10］。李富威等［11-12］应用天根试剂盒提取木瓜汁、香蕉汁及食品中的DNA，建立了食品中木瓜和香蕉成分的基因检测方法，韩建勋等［13］使用改良CTAB法提取梨汁、苹果汁中的DNA，建立了果汁中梨成分的实时荧光PCR检测方法，但是，沈夏艳等［14］采用改良试剂盒法提取的澄清苹果汁DNA浓度较低，且果肉型苹果汁提取纯度也不高，Chang-Chai Ng等［15］采用改良CTAB方法可以提取鲜榨橙汁DNA，但不适合提取果汁饮料等的DNA。虽然从果汁中提取DNA的研究较多，但大部分集中在单一或较少种类的果汁上，且有效性不高，而关于多种果汁的高效通用DNA提取方法研究较少。

本文以汇源100%苹果汁等7种浑浊果汁和百森红苹果汁等6种澄清果汁为研究对象，对比CTAB法、试剂盒法、改良CTAB法提取果汁DNA的浓度、纯度及PCR扩增效率，以期获得高效通用的果汁DNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

果实样品1种，桃;浑浊果汁样品7种，包括鲜果粒苹果汁(A)、汇源100%桃汁(B)、汇源山楂汁(C)、兰芝蓝莓原浆(D)、鲜果粒橙汁(E)、茹梦芒果汁(F)、汇源100%梨汁(G);澄清果汁样品6种，包括百森红苹果汁(a)、汇源冰糖葫芦(b)、青苹果蓝莓汁(c)、康师傅鲜果橙(d)、汇源100%葡萄汁(e)、梨工场冰糖雪梨(f)，均购于北京超市。

1.2 试剂

DNA提取试剂:CTAB裂解液(20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.02 mol/L Na2EDTA，pH=8)，CTAB 沉淀液(5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl)，STE 核分离液(700 mmol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L EDTA，20 g/L PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)，pH=8)，CTAB核裂解液(20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.05 mol/L EDTA，20 g/L PVP-40，pH=8)，1.2 mol/L NaCl溶液，3.2 mol/L NaCl溶液(pH=5.2)，Tirs饱和酚/三氯甲烷(体积比25∶24)，三氯甲烷/异戊醇(体积比24∶1)。其他试剂或溶剂均为分析纯级或生化纯级。

DP305植物基因组提取试剂盒:天根生化科技有限公司;PCR扩增采用的 Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs，购于北京全式金生物有限公司;RNaseA，DNA Marker DL 2 000;PCR扩增引物，由英潍捷基(上海)生物有限公司合成。

1.3 主要仪器与设备

微量移液器，德国 Eppendorf公司;离心机(5804R型，5424型)，德国 Eppendorf公司;超微量核酸蛋白分析仪(Biodrop)，英国柏点公司;普通PCR扩增仪，英国BIOMETRA公司;电泳仪(JY-300C)，北京君意仪器公司;凝胶成像仪，法国VILBER公司。

1.4 DNA提取方法

1.4.1 CTAB 法［16］

对于浊汁，取30 mL果汁于50 mL离心管中，8 679 r/min离心10 min，弃上清液;加入5 mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液，振荡混匀，65℃温浴1 h，期间混匀几次;8 679 r/min离心15 min，将1 mL上清液移至新的2 mL离心管中，加入700 μL的三氯甲烷，振荡均匀，11 684 r/min离心10 min;吸取650 μL上清液移至2 mL离心管中，加入1.3 mL CTAB沉淀液，剧烈混匀，室温静置1 h;11 684 r/min离心10 min;加入350 μL NaCl(1.2 mol/L)溶液，剧烈振荡，再加入350 μL三滤甲烷，剧烈振荡，11 684 r/min离心10 min，吸取上清移至新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，-20℃静置30 min;11 684 r/min离心20 min，弃上清液，加入500 μL体积分数70%乙醇洗涤沉淀，11 684 r/min离心20 min;弃上清，将离心管倒置于超净工作台上10～15 min，吹干沉淀;用50 μL无菌超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用。

对于清汁，取30 mL果汁至洁净培养皿中，真空干燥至剩余1 mL液体(若不足，加无菌超纯水补足)，将液体转移至15 mL离心管中，加入5 mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液，振荡混匀，65℃温浴1 h，期间混匀几次;其余步骤同浊汁。

1.4.2 试剂盒法

对于浊汁，取果汁1 mL装入2 mL离心管中，加入700～800 μL缓冲液GP1，涡旋振荡30 s。随后按照天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒的步骤对样品进行DNA提取。

对于清汁，取30 mL果汁至洁净培养皿中，真空干燥至剩余1 mL液体(若不足，加超纯水补足)，将液体转移至2 mL离心管中，加入700～800 μL缓冲液GP1，涡旋振荡30 s。随后按照天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒的步骤对样品进行DNA提取。

1.4.3 改良CTAB法

对于浊汁，取果汁1 mL于2 mL离心管中，加入1 mL异丙醇，混匀，-20℃静置30 min，12 000 r/min，4 ℃，离心10 min，弃上清，在沉淀中加入600 μL STE核分离液，混匀，4℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清，在沉淀中加入700 μL CTAB核裂解液，14 μL β-巯基乙醇，混匀，65℃温浴1 h，期间不时轻轻摇动离心管几次，取出后，加入等体积Tirs饱和酚/三氯甲烷，振荡混匀，静置5 min，4℃，12 000 r/min离心10 min，取上清，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇，振荡混匀，静置5 min，4℃，12 000 r/min离心10 min，取上清，加入1/10体积3.2 mol/L NaCl，等体积预冷的异丙醇，混匀，-20℃静置1 h，4℃，12 000 r/min离心15～20 min，弃上清，70%乙醇洗沉淀2次，倒置晾干后加入50 μL无菌超纯水，混匀，-20℃保存。

对于清汁，取30 mL果汁于50 mL离心管中，11 000 r/min，4 ℃，离心 10 min，弃上清;向沉淀中加入3 mL STE核分离液，混匀，分2次转入2 mL离心管，4℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清，在沉淀中加入 700 μLCTAB 核裂解液，14 μL β-巯基乙醇，混匀，65℃温浴1 h，期间不时轻轻摇动离心管几次，其余步骤同浊汁。

1.5 DNA提取质量的测定

取DNA溶液1 μL，用超微量核酸蛋白分析仪(Biodrop)测定以上3种方法提取的DNA在光波260 nm和280 nm处的紫外吸收值，通过OD260/OD280和浓度值判断DNA的纯度和浓度，每份样品重复测定3次。

用通用引物18SrDNA基因对提取的样品DNA进行扩增，以验证提取的果汁DNA分子是否适合于PCR分析，扩增片段长度为137 bp。

引物序列为:

18S rDNA-F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA;

18S rDNA-R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT。

扩增体系:DNA模板2 μL;10×PCR反应缓冲液2.5 μL;dNTPs(10 mmol/l)2 μL;上、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL;Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL)0.25 μL，用无菌水补至总体积为25 μL。扩增反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环;72℃延伸5 min。反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

2 结果与分析

2.1 果汁DNA提取效率的比较

2.1.1 浑浊果汁DNA提取效率比较

用CTAB法、试剂盒法法以及改良CTAB法提取7 种浑浊果汁饮料(A、B、C、D、E、F、G)的基因组，用Biodrop超微量核酸蛋白分析仪测定以上3种方法提取的DNA的纯度和浓度，结果列于表1。

用超微量核酸蛋白分析仪测定在260 nm和280 nm处的紫外吸收值分别代表核酸、蛋白质等有机物的吸光度值。对于高质量的DNA样品，OD260/OD280应在1.8左右。当 OD260/OD280小于1.8时，说明DNA中存在蛋白质和酚类物质的污染;反之，说明DNA样品存在RNA或小分子核酸污染。从表1数据可以看出，除茹梦芒果汁(F)外，试剂盒法(天根植物基因组提取试剂盒)在其余浑浊果汁饮料的核酸提取上，效果不理想。CTAB法在提取鲜果粒橙汁(E)、茹梦芒果汁(F)DNA时，浓度较高，但纯度较差，而在其他果汁样品DNA提取时，浓度较低。改良CTAB法提取的DNA样品的OD260/OD280，相对另2种方法更接近1.8，且DNA浓度更高，说明使用改良CTAB法更适合提取浑浊果汁DNA，其中，应用改良CTAB法提取兰芝蓝莓原浆(D)的DNA时，浓度较低，可能是由于蓝莓中花青素含量过多，影响了核酸的释放。

表1 不同方法提取的浑浊果汁DNA浓度和纯度的比较(a±SD，n=3)Table 1 Comparison of purity and concentration of DNA extracted from juice nectar by different methods(a±SD，n=3)

2.1.2 澄清果汁DNA提取效率的比较

用CTAB法、试剂盒法以及改良CTAB法提取6种澄清果汁饮料(a，b，c，d，e，f)的基因组，用 Biodrop超微量核酸蛋白分析仪测定以上3种方法提取的DNA的纯度和浓度，结果列于表2。

从表2数据可以看出，试剂盒法(天根植物基因组提取试剂盒)无法提取到6种澄清果汁饮料中的核酸。CTAB法提取的青苹果蓝莓汁(c)和康师傅鲜果橙(e)DNA，浓度相对较高，但纯度较差，而提取的其他澄清果汁样品DNA，浓度较低，纯度也较差，且无法提取到汇源100%葡萄汁(e)的DNA。改良CTAB法提取的澄清果汁的 DNA，浓度相对更高，OD260/OD280相对更接近1.8，说明改良CTAB法是较为合适的澄清果汁DNA提取方法。其中，应用改良CTAB法提取百森红苹果汁(a)和梨工场梨汁(f)的DNA时，浓度较低，可能是由于多酚类物质氧化物的存在，影响了核酸的释放。

表2 不同方法提取的澄清果汁DNA浓度和纯度的比较(a±SD，n=3)Table 2 Comparison of purity and concentration of DNA extracted from clarified fruit juice by different methods(a±SD，n=3)

2.2 PCR扩增结果

以桃果肉DNA作为阳性对照，细菌DNA作为阴性对照，用通用引物18Sr DNA基因对CTAB法、试剂盒法和改良CTAB法提取的7种浑浊果汁饮料和6种澄清果汁饮料的基因组DNA进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果见图1～图3。

对比图1～图3可知，相对于CTAB法和试剂盒法，改良CTAB法提取的浑浊果汁DNA样品，均可扩增出18SrDNA基因的对应条带，且条带较为清晰、明亮，但3号、4号条带相对较暗，这可能是汇源山楂汁(C)和兰芝蓝莓原浆(D)相对较低的DNA浓度导致的;同时，3种方法中，只有改良CTAB法提取的澄清果汁DNA样品，对18Sr DNA基因的137 bp大小的目的片段均出现阳性扩增，但由于澄清果汁DNA含量普遍较低，故扩增出的目的条带较阳性条带暗。

综上，改良CTAB法提取的浑浊果汁和澄清果汁基因组DNA均可用于后续的PCR检测研究。

图1 CTAB法提取的果汁基因组18SrDNA基因PCR电泳检测图谱注:1.空白对照:无菌超纯水;2.阳性对照:桃;3.汇源100%苹果汁(A);4.汇源100%桃汁(B);5.汇源山楂汁(C);6.兰芝蓝莓原浆(D);7.鲜果粒橙汁(E);8.茹梦芒果汁(F);9.汇源100%梨汁(G);10.阴性对照:细菌;11、12.DNA相对分子质量标记(2000);13.百森红苹果汁(a);14.汇源冰糖葫芦(b);15.青苹果蓝莓汁(c);16.康师傅鲜果橙(d);17.汇源100%葡萄汁(e);18.梨工场冰糖雪梨(f);19.阳性对照:桃;20.阴性对照:细菌;21.空白对照:无菌超纯水。Fig.1 Electrophoresis profile of PCR productsof 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the CTAB method

图2 试剂盒法提取的果汁基因组18SrDNA基因PCR电泳检测图谱注:1.DNA相对分子质量标记(2000);2.汇源100%苹果汁(A);3.汇源100%桃汁(B);4.汇源山楂汁(C);5.兰芝蓝莓原浆(D);6.鲜果粒橙汁(E);7.茹梦芒果汁(F);8.汇源100%梨汁(G);9.空白对照:无菌超纯水;10.阴性对照:细菌;11.阳性对照:桃;12.DNA相对分子质量标记(2000);13.百森红苹果汁(a);14.汇源冰糖葫芦(b);15.青苹果蓝莓汁(c);16.康师傅鲜果橙(d);17.汇源100%葡萄汁(e);18.梨工场冰糖雪梨(f);19.阳性对照:桃;20.空白对照:无菌超纯水。Fig.2 Electrophoresis profile of PCR products amplifiedby 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the DNA extraction kit method

图3 改良CTAB法提取的果汁基因组18SrDNA基因PCR电泳检测图谱注:M.DNA相对分子质量标记(2000);1.汇源100%苹果汁(A);2.汇源100%桃汁(B);3.汇源山楂汁(C);4.兰芝蓝莓原浆(D);5.鲜果粒橙汁(E);6.茹梦芒果汁(F);7.汇源100%梨汁(G);8.空白对照:无菌超纯水;9.阳性对照:桃;10.阴性对照:细菌;11.M.DNA相对分子质量标记(2000);12.百森红苹果汁(a);13.汇源冰糖葫芦(b);14.青苹果蓝莓汁(c);15.康师傅鲜果橙(d);16.汇源100%葡萄汁(e);17.梨工场冰糖雪梨(f);18.空白对照:无菌超纯水;19.阳性对照:桃;20.阴性对照:细菌。Fig.3 Electrophoresis profile of PCR products amplifiedby 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the modified CTAB method

3 讨论

本实验采取3种DNA提取方案从浑浊果汁和澄清果汁中提取DNA，通过比较DNA的纯度、浓度，检验DNA的PCR扩增效率，确定了提取效率较高的方法-改良CTAB法，该方法从前处理方法、裂解液成分和异丙醇沉淀时间等方面对DNA提取方法存在的问题进行了改进。首先，考虑到果汁中DNA含量相对较少，故对浑浊果汁采用异丙醇沉淀的方法对DNA进行富集，对澄清果汁采取离心浓缩的方法进行富集，简单易行，且提高了DNA的得率。其次，果汁样品受次生代谢物质的影响，致使DNA有限释放，故在果汁样品裂解前，预加核分离液去除部分多糖、多酚、色素等杂质，方便有效。再次，为抑制果汁中的多酚氧化并与DNA结合造成的褐变，在裂解液(700 μL)中加入20g/L PVP-40与体积分数2%β-巯基乙醇，从而提高样品DNA的质量以及PCR扩增效率。最后，异丙醇沉淀时间对DNA纯度有重要影响［17］，沉淀时间越长，DNA浓度越高但纯度越低，考虑到果汁DNA的浓度、纯度以及提取过程的时耗，选择在-20℃下沉淀1 h。

最终建立的浑浊果汁和澄清果汁DNA的有效提取方法，简化了实验步骤和时间，提高了DNA的提取效率，可为以后的果汁真实性基因检测提供参考。

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