羊奶中表皮生长因子(EGF)变化规律研究*

云丹，张富新，于玲玲，刘颖沙，侯院林，雷飞艳

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安，710119)

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是美国生化学家Cohen［1-2］于1959年在用羧甲基纤维素纯化小鼠颌下腺神经生长因子(nerve growth factor，NGF)时发现的一种小分子多肽，由53个AA残基构成，等电点(PI)为 4.6，相对分子质量为 6 045Da［3］。后来人们发现，EGF广泛分布于哺乳动物的循环系统、呼吸系统、消化系统、内分泌系统和造血系统［4］，在尿液、胃液、唾液、胆汁、羊水及乳汁等组织液中含量较高［5］。大量研究表明，哺乳动物乳汁中EGF对后代的生长发育有重要影响，作为“胃肠道监视肽”，可刺激整个肠道的DNA、RNA及蛋白质合成，增加胃肠道重量，改善胃酸分泌及肠道酶活性水平，促进新生动物对异体蛋白的消化吸收，催化肠上皮细胞对金属离子的转运和糖代谢，保护胃肠道黏膜，还可促进胎儿器官发育和功能成熟［6-7］。目前有关乳中EGF在人乳中研究报道较多，且人乳EGF浓度远高于其他哺乳动物［8-10］，而对羊乳中EGF研究报道较少。羊乳是人类利用的主要乳源之一，不仅含有人体所需的基本营养成分，还含有大量的生物活性物质，其中EGF作为羊乳中重要的生物活性物质备受人们关注［11］。有研究表明羊乳的化学组成不稳定，乳成分受品种［12］、挤奶间隔［13］、泌乳期［14］等因素的影响较大，其中的EGF浓度也会随之变化。因此，本文对影响羊乳中EGF的因素进行了系统的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

羊乳，选择西北农林科技大学羊场健康奶山羊的乳样。采取人工挤奶方式取样，采样时弃去前3把奶，取挤奶中段的乳样。采样后立即将乳样在-40℃下冷冻储存。

试剂盒，山羊表皮生长因子酶联免疫试剂盒，来自美国R＆D公司，最低检测浓度为1.0 pg/mL。

1.2 仪器与设备

MDF-U5411型低温冰箱，日本三洋电机有限公司;JND-50型培养箱，宁波江南仪器有限公司;TGL-16gR型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;Multiskan Go型全波长酶标仪，美国热电公司;KQ3200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;移液枪(100 ～1 000 μL，10 ～100 μL，0.5 ～10 μL)，德国 eppendorf公司;隔水式恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;ML104型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;GZX-9146 MBE型数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;LS-B型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.3 EGF浓度测定

1.3.1 样品处理

样品处理按照Oslislo［15］的方法并加以改进。将冷冻的乳样在4℃解冻后，用移液枪吸取1 mL乳样置于2 mL离心管中，然后在5 000 g下低温(4℃)离心10 min，去除上层乳脂，取上清液，用ELISA试剂盒测定EGF浓度。

1.3.2 EGF浓度的检测

将EGF试剂盒从4℃的冰箱取出后室温(20℃)平衡20 min，取出试剂盒中的板条。用移液枪取10 μL处理后的乳样加入板条反应孔中，再加样本稀释液40 μL，随后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体50 μL，用封板膜封住反应孔后，在37℃保温60 min。然后弃去反应孔中液体，并在吸水纸上拍干，加入预先稀释好的洗涤液(用蒸馏水按体积比1∶20稀释)350 mL，静置1 min，弃去洗涤液，在吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。在洗涤后的反应孔中加入底物A、B各50 μL，37℃保温15 min后加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔的吸光度值。每个样品重复3次。

1.3.3 标准曲线绘制

将山羊表皮生长因子(EGF)酶联免疫试剂盒中浓度为1 000 pg/mL的EGF标准品用试剂盒中的标品稀释液依次稀释成浓度为 1 000、500、250、125、62.5、0 pg/mL的溶液。各取50 μL加入标准孔，按照1.3.2的方法检测标品在450 nm处的吸光度值，然后以标准品的浓度作为横坐标(x)，对应吸光度值作为纵坐标(y)，绘制EGF标准曲线，计算线性回归方程，按照线性回归方程计算不同样品中的EGF浓度。

1.4 数据的处理

所有数据均采用DPS软件进行处理，并采用Duncan新复极差法进行显著性检验分析。

2 结果与分析

2.1 奶山羊品种对乳中EGF浓度的影响

选择泌乳中期的萨能羊、关中羊、努比羊、圭山羊各5只进行采样，并以牛乳为对照，测定其EGF浓度。结果如图1所示。

图1 奶山羊品种对乳中EGF浓度的影响Fig.1 Effects of goat breeds on the concentrations of EGF in goat milk

由图1可以看出，羊奶中EGF浓度较高，显著高于牛奶中的浓度(P＜0.05)。但不同品种奶山羊所产的羊奶中EGF浓度有较大的变化，其中关中羊所产的羊乳中 EGF浓度最高［(42.67±1.41)ng/mL)］，显著高于其他品种(P＜0.05)，其次是萨能羊，而努比羊和圭山羊所产的羊奶中EGF浓度最低。关于不同奶山羊品种对乳中EGF的研究报道较少，Wu［16］比较了努比羊、莎能羊、阿尔卑斯羊、吐根堡羊、拉曼沙羊奶样的生长因子活性，发现不同品种奶山羊乳中EGF浓度有较大差别，其中努比羊奶中生长因子活性最高。不同哺乳动物乳中EGF之间的差异主要与遗传特性和饲养条件有关［17］，即使同一哺乳动物不同个体之间也存在一定的差异。

2.2 泌乳期对羊乳中EGF浓度的影响

选择10只健康的关中奶山羊，分别于产羔后的第30，60，90，120，150，180，210d 采集乳样，测定其EGF浓度。结果如图2所示。

图2 泌乳期羊乳中EGF浓度的影响Fig.2 Effects of lactation on the concentrations of EGF in goat milk

由图2可以看出，不同泌乳期的羊乳中EGF浓度具有显著性差异(P＜0.05)。分娩后30～90 d EGF浓度最高，显著高于120～210 d乳样中的浓度(P＜0.05)，其中以泌乳高峰期第90天的浓度为最高［(47.65±1.55)ng/mL)］，120～150 d明显下降(P＜0.05)，在之后的180～210 d略有升高，但未高于泌乳高峰期。关于泌乳期对羊乳中EGF浓度的影响未见报道，但在人乳中已有报道，孙晓勉［18］对不同泌乳阶段人乳中EGF浓度变化研究发现乳母乳汁中EGF浓度变化不大(P＞0.05)，这与本研究结果不一致，原因可能是羊乳与人乳泌乳期时间不同。有研究报道，处于泌乳期的奶山羊乳腺中的生长激素不仅可与催乳素共同诱导和维持泌乳，调节乳腺发育和乳汁成分的变化［19］，而且能诱导乳腺导管产生EGF，从而泌乳期生长激素的改变可导致乳腺合成至乳中的EGF 浓度差别较大［20-21］。

2.3 挤奶间隔对羊乳中EGF浓度的影响

选择10只泌乳中期的关中奶山羊，在早上7:30和下午19:30分别挤奶1次，作为挤奶间隔为12 h的乳样。连续采样2 d后，每天只在早上7:30挤奶1次作为挤奶间隔为24 h的乳样，测定其EGF浓度。结果如图3所示。

图3 挤奶间隔对羊奶中EGF浓度的影响Fig.3 Effects of milking intervals on the concentrations of EGF in goat milk

由图3可以看出，12 h和24 h挤奶间隔对关中羊乳中 EGF浓度无显著性影响(P＞0.05)。Wu等［16］对15只努比奶山羊12 h和24 h挤奶间隔乳样中生长因子活性的检测发现，挤奶间隔对乳中生长因子无显著性影响(P＞0.05)，这与本研究的结果一致。Stelwagen［22］报道了乳汁在持续累计21 h后，奶山羊乳腺腺泡上皮细胞的紧密连接开始被打断，血清中的生长因子则以过滤的方式扩散至乳中，然而Dehnhard［23］报道了山羊奶EGF在血清中的含量比乳中的低，因此可以推测羊乳中EGF浓度的变化不仅仅是由于乳腺腺泡上皮细胞的紧密连接被打破的结果。而本研究通过对挤奶间隔的研究表明，山羊奶EGF浓度在24 h挤奶间隔条件下并无明显增加，由此可以看出，24 h挤奶间隔不能升高羊奶中的EGF浓度，此方法不能作为提高乳中EGF浓度的途径。但是曹秀莲［24］研究发现，增加挤奶次数可提高羊奶日泌乳量，因此选择12 h挤奶间隔的乳样。

2.4 泌乳量对羊奶中EGF浓度的影响

选择日泌乳量分别为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 kg的关中奶山羊各5只采集乳样，测定EGF浓度。结果如图4。

由图4可以看出，随着日泌乳量的增加，羊奶中EGF浓度呈现逐渐减小的趋势，当日泌乳量为1.0 kg时，乳中EGF浓度最高，且显著高于其他泌乳量的乳样(P＜0.05);当日泌乳量大于2.5 kg时，乳中EGF浓度逐渐下降，日泌乳量为2.0～3.0 kg时，EGF浓度趋于稳定(P＞0.05)。由此可见，乳中EGF浓度受泌乳量的影响较大，日泌乳量越小，乳中EGF浓度越高。泌乳量对羊乳中EGF浓度影响未见报道，但泌乳量对牛奶成分的影响已有报道，吴海涛等［25］对泌乳量对牛奶中的脂肪影响研究表明，随着泌乳量的增大，牛奶中脂肪含量有所降低，而 Brown等［26］认为，乳腺细胞合成分泌EGF主要是通过合成为乳脂肪膜结合性EGF，然后释放至乳中，由此可推测泌乳量较低时，乳中脂肪含量较高，从而导致分泌至乳中的EGF浓度也会增加。

图4 日泌乳量对羊奶中EGF浓度的影响Fig.4 Effects of milk yields on the concentrations of EGF in goat milk

2.5 胎次对山羊奶EGF浓度的影响

选择产羔第1～7胎的关中奶山羊，在泌乳中期采集乳样。测定其EGF浓度。结果如图5所示。

图5 胎次对山羊奶EGF浓度的影响Fig.5 Effects of goat parity on the concentrations of EGF in goat milk

由图5可以看出，奶山羊产羔第1胎的乳中EGF浓度较低(P＜0.05)，产羔2～5胎时，羊乳中EGF浓度显著增大(P＜0.05)，其中产羔第5胎时，羊乳中的EGF浓度达到最高［(43.40±1.75)ng/mL)］，但在产羔第5胎以后，羊乳中的EGF浓度逐渐降低(P＜0.05)。乳中的EGF主要是由乳腺细胞合成分泌［27］，乳腺细胞的发育程度与乳营养成分的合成分泌密切相关［28，29］，奶山羊第 1胎产羔后乳腺细胞发育不完全;在第2胎产羔后，乳腺上皮细胞发育趋于成熟，合成分泌生物活性物质的能力也有所提高，释放至乳中的EGF也有明显的增加;但在奶山羊产羔第5胎之后，其乳腺上皮细胞逐渐衰老退化，分泌合成乳成分的能力降低，导致EGF浓度降低。

3 结论

通过对羊奶中EGF浓度变化规律研究表明，发现关中奶山羊所产羊乳中EGF浓度最高;对于不同泌乳期的羊乳，30～90 d时EGF浓度较高;挤奶间隔对乳中EGF浓度无显著性影响;奶山羊日泌乳量越小，乳中EGF浓度越高;产羔后2～5胎的羊乳中EGF浓度较高。因此，在开发富含EGF的功能性羊奶产品时，可收集泌乳期为30～90 d，挤奶间隔为12 h，日泌乳量小，2～5胎的关中奶山羊乳样。

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