SNAPIN基因对受体酪氨酸激酶c-MET在HEK 293T细胞中表达的影响

高迎春，张传领，牛丽丽，温建勋，程国强，肖 瑞(内蒙古医科大学内蒙古自治区分子病理学重点实验室，呼和浩特 00059;内蒙古医科大学药学院;共同第一作者;通讯作者，E-mail:xiaorui79@hotmail．com)

SNAPIN 蛋白(SNAP-associated protein，SNAPAP;BLOC1S7)又称突触小体相关蛋白，最初是在神经细胞中作为与可溶性NSF附着蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE)复合物中的SNAP-25蛋白结合被发现的，在神经元中表达量丰富，主要分布在突触囊泡膜上［1］，参与囊泡融合以及神经递质的释放。后有研究发现SNAPIN在神经细胞和非神经细胞的胞质中均有表达。

SNAPIN是由136个氨基酸组成的相对分子质量约为15 000的蛋白，其二级结构大部分为α螺旋［2］，N末端有一个疏水区(1-20aa)，C末端有由两个螺旋区H1和H2形成的卷曲螺旋(coiled-coil)，该螺旋结构域在许多囊泡融合蛋白中保守存在。研究发现SNAPIN蛋白功能的发挥主要通过卷曲螺旋与其他蛋白相互作用来实现。SNAPIN是一种广泛表达的蛋白，在心脏、肝脏、肾脏中均有表达［3］，提示该蛋白可能在不同组织中发挥不同的作用。SNAPIN除与SNAP25结合之外，还与雌激素受体结合位点相关抗原 9(EBAG9)［4］，cypin［5］，casein kinase 1-delta［6］，a subunit of Exo70［7］，经典瞬时受体电位 6(TRPC6)［8］，膜转运调控蛋白 1(EHD1)［9］，腺苷酸环化酶Ⅵ(type Ⅳ adenylyl cyclase)［10］，ryanodine receptor［11］，受体酪氨酸激酶 c-MET［12］，UT-A1 urea transporter［13］等蛋白相互作用。其中 c-MET酪氨酸激酶受体主要在上皮细胞中表达，参与胚胎发育、创伤恢复、组织重生和形态分化等;在病理状态下，c-MET和肝细胞因子(hepatocyte growth factor，HGF)可诱导肿瘤细胞的增殖、细胞扩散、血管形成、细胞黏附、细胞侵袭、细胞运动和抗凋亡等作用。

本实验通过实时定量PCR的方法在转录水平上来研究SNAPIN基因沉默和过表达后，其相互作用蛋白c-MET的表达，观察SNAPIN蛋白的表达及其对相关蛋白c-MET表达是否具有调控作用。

1 材料和方法

1．1 实验材料

HEK 293T细胞(人胚肾上皮细胞系)购置于上海中科院细胞库，质粒pEGFP-C1(内蒙古医科大学师永红馈赠)，大肠杆菌DH5a(内蒙古自治区分子病理学重点实验室保存)，限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ(Takara，Japan)，分子质量标准品(DL3000，天根生物)，Stealth siRNA sets(Cat．1299001，Invitrogen，USA)，Trizol(上海生工)，反转录试剂盒(Takara，Japan)，SYBR green荧光定量PCR试剂盒(Takara，Japan)，质粒提取试剂盒(天根生物)，胶回收试剂盒(Qiagen，USA)，PCR引物合成及重组质粒测序(上海生工)，DMEM培养基(Gibco，USA)，胎牛血清(杭州四季青)，LipofectamineTM2 000(Invitrogen，USA)。

1．2 方法

1．2．1 重组载体构建 以Trizol法提取HEK 293T细胞的总RNA，反转录为cDNA，PCR扩增获取全长产物，上游引物:5'-ATC TCG AGC AGG ACA ATT CGT GAT GG-3'(含XhoI酶切位点);下游引物:5'-GAA TTC TCA TCT GTT ATT TGC CTG GG-3'(含EcoRⅠ酶切位点)。PCR产物大小约431 bp。扩增条件:95℃预变性5 min，94℃ 30 s，59℃30 s，72 ℃ 30 s，循环35 次，72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经酶切纯化后与相同酶切处理的载体pEGFP-C1连接。通过电穿孔转化到E．coli DH5α中，接种培养后，随机挑选单克隆通过PCR，酶切反应和测序鉴定。

1．2．2 细胞培养和转染 HEK 293T细胞用含10%FBS的DMEM高糖培养液培养，按2×105个细胞/孔接种于无菌6孔板中，次日待细胞生长至60%-70%融合度时进行转染。按LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒说明，将pEGFP-SNAPIN(过表达重组质粒)或Stealth siRNA(RNA干扰片段)分别转染至HEK 293T细胞中培养24-48 h，收集细胞进行基因表达检测。同时设立未转染细胞对照组。以上各细胞为同代细胞，细胞计数和培养条件等均保持一致，实验重复3次。

1．2．3 RNA提取和实时定量PCR Trizol法提取总RNA，以2 μg总RNA为模板进行逆转录，以表1引物、SYBR Green荧光染料(Takara，Japan)相对定量PCR检测，以GAPDH为内参。反应条件为:95℃预变性15 s，95℃变性15 s，退火15 s(退火温度见表1)，72℃延伸20 s，共40个循环。引物设计采用primer 5．0软件，委托上海生工公司合成(见表1)。

表1 实时定量PCR实验的引物序列和相应的退火温度Table 1 Primer sequences and corresponding annealing temperature for real-time PCR

1．3 数据分析和统计处理

实时定量 PCR结果采用2-ΔΔCt法，其中 ΔΔCt=(Ct目标基因-Ct内参基因)样本-(Ct目标基因-Ct内参基因)对照。数据以±s表示，采用SPSS 10．0统计软件进行t检验。各组间样本均数进行单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 RT-PCR反应扩增SNAPIN全长基因

通过PCR扩增获得人的SNAPIN全长基因(431 bp，见图 1)。

图1 PCR扩增获得人全长SNAPIN基因Figure 1 The amplification of SNAPIN mRNA by PCR

2．2 pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达重组载体的构建

随机挑选6个转化质粒进行PCR验证，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示6个质粒中均可扩增出全长SNAPIN基因，提示重组载体构建成功(见图2)。针对其中两个转化质粒进行XhoⅠ和EcoRⅠ酶切反应，验证重组载体构建成功(见图3)。将上述方法验证过的重组质粒进行双向测序，测序结果(见图4)经BLAST比对后证实SNAPIN成功插入PEGFP载体中。以上三种验证方法证明成功构建pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达重组载体。

图2 PCR反应扩增SNAPIN验证重组质粒Figure 2 The recombinant plasmids confirmed by PCR

2．3 HEK 293T细胞的转染

转染48 h后在荧光显微镜下观察细胞转染效率(见图5)，结果显示转染效率较高，可用于后续分析。

图3 酶切反应验证重组质粒Figure 3 The identification of recombinant plasmids by double enzyme digestion

图4 pEGFP-SNAPIN重组质粒测序结果原始图谱Figure 4 The partial sequencing result of pEGFP-SNAPIN

图5 转染pEGFP-SNAPIN后的HEK 293T细胞Figure 5 The pEGFP-SNAPIN transfected HEK 293T cells

2．4 实时定量PCR检测转染后SNAPIN、c-MET的表达

分别用构建好的pEGFP-SNAPIN表达载体和合成的siRNA SNAPIN干扰片段转染到HEK 293T细胞后用ABI的7500fast荧光定量PCR仪进行定量PCR实验，检测 SNAPIN表达的改变。SNAPIN、c-MET和GAPDH的扩增曲线良好，说明反应正常进行。融解曲线呈单峰，说明引物扩增特异性强(见图6)。

图6 SNAPIN，GAPDH，c-MET的融解曲线Figure 6 The melting curves of SNAPIN，GAPDH and c-MET gene

实时定量PCR实验结果显示转染了表达质粒pEGFP-SNAPIN后的HEK 293T细胞中SNAPIN的表达量显著上调(P＜0．05，见表2)，在siRNA沉默SNAPIN基因后，转录水平上SNAPIN的表达下调(P＜0．05)。在 SNAPIN过表达的细胞中，c-MET的表达随之显著上调 1．75倍(P＜0．05);反之SNAPIN基因沉默后，分析发现c-MET的表达也随之下调，是正常细胞表达水平的 0．73倍(P＜0．05)。

表2 SNAPIN、c-MET和GAPDH实时定量PCR中相对表达结果Table 2 The relative expression of SNAPIN，c-MET and GAPDH by real-time quantitative PCR

3 讨论

SNAPIN蛋白在神经细胞和非神经细胞中表达，在人全身各组织中均有表达，提示该蛋白具有广泛的生物学功能。由Kunt＆AliceWallenberg基金支持近期开展的Human Protein Atlas项目中发现SNAPIN除了在正常组织中表达外，还在多种肿瘤组织中表达，尤其是结直肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、子宫内膜癌等中高表达(http://www．proteinatlas．org/ENSG00000143553-SNAPIN/cancer)。SNAPIN也可以与很多不同生理过程中的蛋白相互作用，说明SNAPIN是一个多功能蛋白，最新研究发现，SNAPIN和体外放射治疗缓解期的非转移性前列腺癌男性的疲劳恶化相关［14］。

在Christian等［15］2004年的研究中发现SNAPIN可与原癌基因编码的蛋白产物c-MET相互作用，该蛋白是肝细胞生长因子受体酪氨酸激酶，其与多种癌基因产物和调节蛋白相互作用，参与细胞信息传导、胚胎发育、细胞骨架重排的调控以及肿瘤发生过程，是细胞增殖和分化重要因素。c-MET在多种肿瘤中，如胃肿瘤、弥散型星形细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌高表达，可增加蛋白转录而减少基因扩增，且c-MET的高表达与耐药性相关［16］。

SNAPIN是c-MET的相互作用蛋白，而SNAPIN的另一个相互作用蛋白SNAP-25可以与肝细胞生长因子调控的酪氨酸激酶作用底物HRS发生作用，该蛋白通过将c-MET定位至溶酶体而参与c-MET的降解过程。而本研究发现c-MET在HEK 293T细胞的表达受到SNAPIN的调控，提示在HEK 293T细胞中SNAPIN可能通过与c-MET结合来调控c-MET的表达，提示SNAPIN很可能与这些蛋白做为一个蛋白复合体而存在，或者参与调控该生理过程。由于在不同细胞、不同分化阶段作用的底物不同，c-MET在不同的条件下表现出多种不同的功能，如促进肝细胞、内皮细胞和黑色素细胞的分裂;引起上皮细胞的分散，在胚胎发育过程中控制细胞的移动;诱导细胞形态变化等。以上研究提示我们，SNAPIN可能调节c-MET参与细胞生理过程，但具体作用机制仍需进一步研究，本研究对于揭示SNAPIN蛋白在其他生理途径中的功能是非常有意义的。

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