石斛合剂对2型糖尿病模型大鼠脂肪组织内脂素基因表达的影响

严晓丹，王 林，郑雪花，黄灵艳(福建中医药大学中西医结合学院，福州 350;福建省血液中心)

糖尿病作为一种由遗传和环境因素相互作用所致的临床综合征，发病率在全球范围每年都有增长。本课题组近年来在临床上开展石斛合剂加减方治疗2型糖尿病取得良好效果［1］，因此我们通过高脂高糖饮食喂养加注射链脲佐菌素建立2型糖尿病模型，测定血糖血脂、内脂素等指标，探讨内脂素和2型糖尿病的关系，以揭示石斛合剂治疗糖尿病的分子机制。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 健康成年SD雌性大鼠40只，体重210－230 g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号:SCXK(沪)2007－0005。

1．1．2 药品和试剂 石斛合剂(石斛、黄芪、丹参、生地黄)购自福建中医药大学国医堂;链脲佐菌素(美国Sigma公司)，临用时用0．1 mol/L柠檬酸钠－柠檬酸缓冲液(pH4．3)配成0．25%链脲佐菌素溶液;血糖试剂盒(上海复旦大学张江生物医药股份有限公司);Trizol试剂(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司);引物(上海英俊生物有限公司);Perfect Real Time(日本Takara公司)。

1．1．3 仪器 ELX800酶标仪(Bio-Tek);Stratos冷冻离心机(Thermo Scientific);DU730蛋白核酸分析仪(Beckman Coulter);Eppendorf5331基因扩增仪(Eppendorf基因有限公司);Gel doc xr凝胶电泳成像分析系统(Bio-Rad);DYY-6C双稳定时电泳仪(北京市六一仪器厂);DYCP-31DN水平电泳槽(北京市六一仪器厂);ULT-1386－5V超低温冰箱(美国Thermo);Epgradient S实时荧光定量PCR仪(Eppendorf基因有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 动物模型制备 健康成年SD雌性大鼠40只，造模前适应性喂养1周，按体质量随机分为正常组10只，造模组30只，两组大鼠自由饮水进食。正常组给予基础饲料喂养，造模组给予高脂高糖饲料(蔗糖10%、猪油10%、胆固醇2．5%、胆酸钠0．25%、基础饲料87．75%)喂养。1个月后造模组给予低剂量链脲佐菌素，按25 mg/kg体重，一次性腹腔注射，其后自由进食基础饲料72 h。微量血糖仪检测血糖含量，随机血糖≥16．7 mmol/L为造模成功，随后连续2周，每周测3次随机血糖，≥16．7 mmol/L为稳定模型。

1．2．2 动物分组及给药 正常对照组:清洁级SD大鼠10只，按1 ml/100 g体重给予生理盐水灌胃;2型糖尿病模型组:稳定模型大鼠12只，按1 ml/100 g体重给予生理盐水灌胃;石斛合剂干预组:稳定模型大鼠12只，按1 ml/100 g体重给予石斛合剂灌胃，相当于生药量12 g/(kg·d)，灌胃6 d，休息1 d，连续8周。

各组大鼠于末次给药后，禁食15 h，以20%乌拉坦进行腹腔注射，抽取腹主动脉血液并分离血清，于－20℃保存备用，取脂肪组织液氮保存备用。

1．2．3 脂肪组织内脂素(Visfatin)mRNA表达水平检测 ①总RNA的提取。取300 mg肠系膜脂肪组织，按照试剂盒操作方案提取总RNA，用紫外分光光度计测定OD260/OD280的比值，并计算浓度。②逆转录反应。每个样品取5 μg总RNA为模板，使用qRT-PCR试剂盒(Invitrogen公司)采用Oligo(dT)20引物进行逆转录，所合成的cDNA被保存在－20℃低温冰箱。③实时定量PCR。用β-actin作为参考基因，在实时荧光定量PCR仪上进行检测。基因扩增引物按照cDNA序列设计为:内脂素上游引物5'－T CTGGAAATCCGCTCGACAC－ 3'，下游引物5'－AGTAAGTTCCCCTGCCTCAC－3'，扩增产物129 bp。β-actin上游引物5'－ATTGTGATGGACTCCGGAGA－3'，下游引物 5'－CTCGTCAGGATCTTCATGA－3'，扩增产物136 bp。反应条件设定:95℃5min，95 ℃ 15 s，55－60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共45个循环。融解曲线分析:温度60－95℃，每个样本重复3次，以相对表达量(2－ΔΔCt)来表示目的基因mRNA的相对表达水平。ΔΔCt=测试样品ΔCt－对照样品ΔCt;测试样品ΔCt=测试样品目的基因Ct值－测试样品内参Ct值;对照样品ΔCt=对照样品目的基因Ct值－对照样品内参Ct值。

1．3 统计学处理

2 结果

与正常对照组相比，糖尿病模型组血糖、甘油三脂(TG)、总胆固醇(CHOL)均有明显上升(P＜0．01)，说明造模成功;与糖尿病模型组相比，石斛合剂干预组血糖、甘油三脂(TG)、总胆固醇(CHOL)均有明显下降(P ＜0．01，见表 1)，说明石斛合剂对治疗糖尿病有疗效。

与正常对照组相比，糖尿病模型组内脂素(visfatin)的表达上升(P＜0．01);石斛合剂干预组与糖尿病模型组相比，内脂素(visfatin)的表达下降(P＜0．01，见表1)，说明内脂素(visfatin)可能是石斛合剂治疗糖尿病的靶点。

表1 各组血糖和血脂及visfatin mRNA表达量的比较(±s)Table 1 Comparison of blood glucose，blood lipid and visfatin mRNA level among in three groups(±s)

表1 各组血糖和血脂及visfatin mRNA表达量的比较(±s)Table 1 Comparison of blood glucose，blood lipid and visfatin mRNA level among in three groups(±s)

与正常对照组比较，*P＜0．01;与糖尿病模型组比较，#P＜0．01

组别 n 血糖(mmol/L) TG(mmol/L) CHOL(mmol/L)visfatin正常对照组10 5．21 ±1．17 0．89 ±0．18 1．57 ±0．17 2．15 ±0．58糖尿病模型组 12 19．78 ±3．45* 1．71 ±0．14* 2．78 ±0．26* 5．98 ±1．87*石斛合剂干预组 12 15．98 ±4．12# 1．45 ±0．16# 2．03 ±0．16# 3．21 ±0．98#

3 讨论

内脂素(visfatin)是新近发现的一种脂肪细胞因子，主要由内脏脂肪组织产生，它可通过与胰岛素受体结合，增加脂肪细胞和肌细胞对葡萄糖的摄取，抑制肝糖原的释放［4］，具有类胰岛素样的降血糖作用。近年来研究发现，2型糖尿病患者血浆中visfatin水平明显增高，相关分析显示，visfatin水平是2型糖尿病的独立相关因素［5－7］。

传统中医认为，临床2型糖尿病从早期到晚期主要呈现阴虚热盛证到气阴两虚证，最终阴阳两虚证的病程进展，且血瘀贯穿始终。在此基础上，我们认为2型糖尿病属虚实夹杂疾病，且虚实二者互为因果、恶性循环，构成了2型糖尿病及其并发症发生和发展的病理基础。为此，我们以扶正祛邪为总则，形成了以滋阴清热、益气活血、兼以疏肝解郁、清肝泄浊的石斛合剂，我们以高脂高糖加注射链脲佐菌素造模的2型糖尿病大鼠模型为研究对象，给予石斛合剂组方进行治疗。本课题研究中我们看到模型组大鼠脂肪组织visfatin mRNA表达显著上升，石斛合剂组大鼠脂肪组织visfatin mRNA表达显著下降，血糖、血脂水平与模型组比较显著降低，说明visfatin是石斛合剂治疗糖尿病的靶点。

［1］施红，张学敏，崔乙，等．糖尿病石斛合剂序贯法的初步临床观察［J］．中医临床研究，2013，5(18):1－3．

［2］洪佳祝，刘宏波，高长花，等．石斛合剂序贯方基础上运用温病理论指导加减治疗糖尿病［J］．中国医药指南，2014，12(15):274－275．

［3］张捷平，郑晓玲，洪佳祝，等．复方石斛合剂治疗2型糖尿病90例［J］．福建中医药大学学报，2011，21(5):6－8．

［4］Fukuhara A，Matsuda M，Nishizawa M，et al．Visfatin:a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin［J］．Science，2005，307(5708):426－430．

［5］Chen MP，Chung FM，Chang DM，et al．Elevated plasma level of visfatin/Pre-B cell colony-enhancing factor in patients with type 2 diabetes melitus［J］．Clin Endocrinol Metab，2006，91(1):259－299．

［6］Dogru T，Sonmez A，Tasci I，et al．Plasma visfatin levels in patients with newly diagnosed and untreated type 2 diabetes mellitus and impaired glucose tolerance［J］．Diabetes Res Clin Pract，2007，76(1):24－29．

［7］Haider DG，Schaller G，Kapiotis S，et al．The release of the adipocytokine visfatin is regulated by glucose and insulin［J］．Diabetologia，2006，49(8):1909－1914．