人源性促甲状腺激素受体抗体Fab段抗体库的构建

杜晓明 李宁 宋春青 方佩华

人源性促甲状腺激素受体抗体Fab段抗体库的构建

杜晓明 李宁 宋春青 方佩华

目的 通过噬菌体表面展示技术，构建人源性促甲状腺激素受体抗体（TRAb）Fab片段抗体库。方法 从甲状腺功能亢进症患者外周血单个核细胞抽提总RNA，PCR法扩增免疫球蛋白分子轻链κ、λ基因及重链Fd基因。构建轻链文库及组合文库。一个随机的组合文库在噬菌体表面表达。结果 从外周血单个核细胞中抽提得到总RNA，并反转录获得cDNA文库。PCR法扩增了大小约为680 bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因，并构建了库容为1.32×105基因抗体库(轻链库)和库容为2.28×105Fab抗体库（组合文库）。Fab组合文库转化到大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，在辅助噬菌体M13K07的辅助下，扩增得到噬菌体抗体库。结论 噬菌体表面展示技术可成功构建人源性TRAb Fab片段组合文库。

噬菌体表面展示技术；人源性单克隆抗体；促甲状腺激素受体抗体Fab

组合抗体库是继杂交瘤技术之后，抗体研究领域取得的一大进展。该技术依赖于噬菌体表面展示技术的建立。噬菌体表面展示技术通过富集筛选抗体、抗原，可在短期内筛选到较高亲和力的抗体。来源于免疫库的抗体，其特性偏向于免疫的特定靶抗原。因此，通过宿主的免疫系统，虽然能够获得高亲和、高特异的抗体，但为了获得与体内相似的成熟过程，相对于每个单个的抗原，需要构建新的抗体库[1]。

促甲状腺激素受体抗体（TRAb）是自身免疫性甲状腺疾病中的特异性抗体。本实验构建的TRAb Fab噬菌体抗体库为免疫抗体库，有利于获得高丰度的TRAb Fab表达基因。

1 材料和方法

1.1 材料 大肠杆菌XL1.Blue为本室保存。促甲状腺激素（TSH）-N为天津医科大学总医院核医学科制备。Horizon 58Gel凝胶电泳仪为美国GIBCOBRL公司产品。噬菌粒pComb3Hss为海军总医院周丽君教授惠赠。辅助噬菌体M13K07为New England公司产品。化学感受态XL1-Blue为北京全世金生物技术有限公司产品。血液总RNA快速提取试剂盒购自Biotech公司。限制性内切酶SacⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ、SpeⅠ、T4DNA连接酶购自大连宝生物公司。引物由Invitrogen公司合成。

1.2 RNA提取、引物和PCR扩增 选取3例天津医科大学总医院门诊确诊为Graves病的患者（TRAb＞0.04 IU/L）为研究对象。取患者抗凝外周血，用血液总RNA快速提取试剂盒提取外周血RNA，以Olig（dT）为引物，合成cDNA第一链，反转录合成cDNA。以Coronella等[3]报道的设计方案设计一组兼并引物，该引物以人抗体可变区胚系基因序列为基础，上游引物位于可变区的第一骨架区（FR1），轻链下游引物位于恒定区（CL），重链下游引物位于铰链区（hinge region）。进行PCR扩增，条件为:95℃变性3min，循环中模板变性30 s，κ、λ轻链及重链基因退火温度分别为 62℃、56℃、58℃，时间 30 s，72℃延伸1min，共35个循环，继之72℃延伸10 min，4℃终止。

PCR 引物：（1）轻链（λ）可变区引物 VL4B：5'-CCG（GAGCTC）CAGCCTGTGCTGACTCARYC-3'；（2）轻链（λ）恒定区引物 CL2：5'-CGCCG（TCTAGA）ACTATGAACATTCTGTAG-3'；（3）轻链（κ）可变区引物 VK1B：5'-CCG（GAGCTC）GACATCCRGDTGACCCAGTCTCC-3'；（4）轻链（κ）可变区引物 VK9B：5'-CCG（GAGCTC）GATATTGTGMTGACBCAGWCTCC-3'；（5）轻链（κ）恒定区引物CK1Z：5'-GCGCCG（TCTAGA）ACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGG GCGATCTCA-3'；（6）重链（H）可变区引物 VH22B：5'-CCG（CTCGAG）CAGGTGCAGCTGGTGSARTCTGG-3'；（7）重链（H）恒定区引物 CG1Z：5'-GCATGT（ACTAGT）TTTGTCACAAGATTTGGG-3'。

1.3 凝胶电泳 应用1%甲醛变性的琼脂糖电泳鉴定RNA完整性、DNA条带以及限制性内切酶酶切产物。

1.4 噬菌体Fab抗体库的构建

1.4.1 构建轻链库 经SacⅠ和XbaⅠ酶切的噬菌粒载体pComb3Hss和轻链PCR产物由T4DNA连接酶连接为环状，经化学转化转入大肠杆菌XL1-Blue中。扩增转化后的细菌，提取质粒得到轻链库载体DNA。

1.4.2 辅助噬菌体敏感宿主菌的制备 接种XL1-Blue于 LB（Luria-Bertani）固体培养基琼脂平板，挑取单菌落接种，培养至对数生长期，取辅助噬菌体M13K07贮存液1μl加入到以上EP管中，孵育，观察菌斑。挑取辅助噬菌体M13K07单个空斑接种菌液扩增。制备好的辅助噬菌体M13K07，滴定不同稀释度的平板，计数空斑数并计算滴度。

1.4.3 TRAb Fab片段噬菌体抗体库的制备 经XhoⅠ和SpeⅠ酶切重链Fd段PCR产物和轻链库，连接后转化，转化后的细菌经适当地扩大培养后，转化到大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，加入约1012空斑形成单位（pfu）的辅助噬菌体13K07，继续培养过夜，次日4000 r/min（r=7 cm）离心菌液收集上清，加入PEG8000 及NaCl，振荡促溶9000 r/min（r=7cm）离心，弃上清，用2ml1%BSA-PBS悬浮噬菌体沉淀，收集上清，加叠氮钠（NaN3）至0.2%，得到噬菌体抗体库。

2 结果

2.1 轻链和Fd段基因的扩增结果 提取外周血细胞总RNA，逆转录合成cDNA，用PCR扩增轻链和Fd段的基因。

（1）RNA凝胶电泳显示5个样本中，第4个RNA条带清晰，28S、18S亮度之比大于1:1，无RNA降解。测OD值约等于1.8，证明RNA无降解，无蛋白质污染，可作为模板进行逆转录（图1）。

图1 外周血总RNA甲醛变性凝胶电泳图

（2）1%琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增IgG1的重链与κ、λ轻链基因片段的长度约为680 bp，符合理论预期值（图 2，3）。

图2 IgG1λ、κ轻链基因引物的扩增产物

图3 IgG1重链Fd基因引物的扩增产物

2.2 噬菌体Fab抗体库的构建和鉴定

2.2.1 轻链文库构建 抽提轻链重组噬菌粒L+P经SacⅠ/XbaⅠ双酶切，电泳结果显示两条长度分别约为3 700 bp与680 bp的DNA条带；经XhoⅠ单酶切，电泳结果显示为一条约为4 300 bp的DNA条带，符合理论预期值（图4）。

图4 轻链重组噬菌粒L+P克隆的单、双酶切鉴定的电泳结果

轻链文库推算转化子数为:1.47×l05cfu。从1μl平板中挑取10个菌落，分别扩增后提取质粒。10份质粒均用SacⅠ和XbaⅠ双酶切处理。其中有9份可以切下约680 bp的片段，故轻链的插入率为90%，实际库容为:1.47×105×90%=1.323×105。

将已构建的轻链库噬粒DNA用SacⅠ和XbaⅠ双酶切，回收纯化经XhoⅠ和SpeⅠ酶切重链Fd段PCR产物和轻链文库，连接后转化。组合文库的插入率为60%，组合文库Fab的库容量为:3.8×105×60%=2.28×105cfu。

2.2.2 Fab组合文库构建 在辅助噬菌体M13K07的辅助下超感染XL1-Blue，次日在Amp平板上可见菌落生长（图5）。挑取菌落后抽提质粒，电泳显示用SacⅠ/XbaⅠ以及XhoⅠ/SpeⅠ双酶切，可释放出约680bp的插入片段，单用XhoⅠ没有释放出插入片段，将闭合状态的抗体库质粒切开为大约4700bp的片段（图 6）。

图5 含有轻链和Fd的重组子转化菌斑

图6 噬菌体Fab抗体库单、双酶切鉴定电泳结果

3 讨论

免疫抗体库的构建来源于不同种类的经抗原免疫的个体。从该类抗体库中便于筛选到针对某一特定抗原的特异性抗体。国内有学者通过制备免疫抗体库得到有一定亲和力及特异性的抗核抗体Fab段[2]。本实验需要筛选的TRAb是自身免疫性甲状腺疾病中的特异性抗体，因此选择了免疫抗体库。

本实验构建的TRAb Fab噬菌体抗体库基因来源于自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞，有利于高丰度TRAb表达基因的获得。对TRAb Fab噬菌体抗体库的菌落的随机检测，应用SacⅠ/XbaⅠ以及XhoⅠ/SpeⅠ双酶切，可释放出约680 bp的插入片段，证实有轻链和重链Fd段插入片段存在，单用XhoⅠ没有释放出插入片段，将闭合状态的抗体库质粒切开为大约4700bp的片段，说明构建抗体库成功。重组产物中包含目的基因，表明库容的有效性良好。本实验采用常规的化学法转化噬菌粒，简单易行，感受态大肠杆菌XL1-Blue库容量在108数量级，考虑抗体库基因来源的高丰度性以及库容良好的有效性，该库容可以满足下一步高亲和力抗体的筛选。

本实验参考Biotherapeutics实验室Coronella等[3]的设计，选择性地合成了一组引物。实验合成的引物为兼并引物，尽量包括抗体重链IgG各亚型，以及抗体轻链κ型和λ型。利用上游和下游不同的引物组合，均扩增出了相应的片段，保证了所需抗体库的多样性。

重组抗体与传统的单克隆抗体在基本功能方面是一致的。而重组抗体能够在体外批量生产，在制备过程中更加灵活，在制成后有更多机会优化，能更方便的制作、筛选、成熟，并且能够选择性进行结构性的改变，这在传统的单克隆技术中是不可能实现的[1]。

单克隆抗体在诊断、治疗和靶向给药系统方面均有潜在的应用，不仅可应用于细菌、病毒和原生动物导致的感染，还可应用于淋巴细胞恶性肿瘤、组织配型、酶联免疫吸附试验、放射免疫以及微生物血清分型[4]。

TRAb可导致Graves病，在不同甲状腺功能亢进症中，TRAb有何作用，TRAb是否可用于Graves病复发、胎儿或新生儿甲状腺毒症的预测，以及临床Graves眼病的临床评估，还需要在临床实践中进一步探索[5]。因此有必要了解TRAb的结构、功能以及临床诊断、治疗方面的应用。

本实验利用噬菌体表面展示技术构建了人源性TRAb Fab段噬菌体抗体库。TRAb为异质性抗体[6]。因此可能通过促甲状腺激素受体抗原，在后续的工作中进一步筛选得到甲状腺刺激性抗体。甲状腺刺激性抗体可用于Graves病诊断技术中的定量检测，而甲状腺刺激阻断性抗体作为阻断性抗体可用于探讨自身免疫性疾病的免疫治疗，为自身免疫性疾病的诊断以及免疫治疗提供新的思路。

［1］Shukra AM，Sridevi NV，Dev Chandran，et al.Production of recombinant antibodies using bacteriophages[J].Eur JMicrobiol Immunol（Bp），2014，4（2）：91-98.

［2］陆慧琦，钱新宇，李爱民，等.人源性抗核抗体Fab片段的筛选及鉴定[J].第二军医大学学报，2008，29（1）：87-91.

［3］Coronella JA，Tellman P，Truong TD，et al.Amplification of IgG VH and VL（Fab）from single human plasma cells and B cells[J].Nucleic Acids Res，2000，28（20）：E85.

［4］Siddiqui MZ.Monoclonal antibodies as diagnostics；an appraisal[J].Indian JPharm Sci，2010，72（1）：12-17.

［5］Barbesino G，Tomer Y.Clinical review：clinical utility of TSH receptor antibodies[J].J Clin Endocrinol Metab，2013，98（6）：2247-2255.

［6］Latif R，Morshed SA，Zaidi M，et al.The thyroid-stimulating hormone receptor：impact of thyroid-stimulating hormone and thyroid-stimulating hormone receptor antibodies on multimerization，cleavage，and signaling[J].Endocrinol Metab Clin North Am，2009，38（2）：319-341.

Construction of Fab fragment library of human thyrotrophin receptor antibody

Du Xiaoming*，Li Ning，Song Chunqing，Fang Peihua.*Department of Endocrinology，Tianjin 4th Center Hospital，Tianjin 300140，China

Fang Peihua，Email：raysinomail@163.com

Objective To constructa Fab fragment library of human thyrotrophin receptor antibody（TRAb）using phagedisplay technology.M ethods TotalRNAwasisolated from peripheralbloodmononuclear cells of patientswith hyperthyroidism.Human immunoglobulinκ/λ light chain and heavy chains Fd genes were amplified by PCR.A lightchain library and a combinatorial librarywere constructed respectively.A random combinatorial librarywasexpressed on thesurfaceof filamentousphage.Results cDNA library was harvested successfully by reverse transcription technology from totalRNA ofperipheralbloodmononuclear cells.Human immunoglobulin 680 bp κ/λ lightchain and heavy chain Fd geneswere obtained by PCR.The size ofκ light chain library was 1.32×105.The actual diversity of Fab combinatorial library was 2.28×105.The Fab combinatorial librarywere transformed in E.coliXL1 Blue.The transformered cellswere infected with M13K07 helper phage to amplify phageantibody Fabs.Conclusion A human TRAb Fab fragmentphage combinatorial library can be constructed by phage surface display technology.

Phage display technology；Humanmonoclonalantibodies；Thyrotrophin receptor antibody Fab

（Int JEndocrinol Metab，2015，35：238-241）

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.04.006

天津市卫生局科技重点项目(2013KR04)

300140 天津市第四中心医院内分泌科（杜晓明，宋春青）；300052 天津医科大学总医院核医学科（李宁，方佩华）

方佩华，Email：raysinomail@163.com

2015-02-24）