糖尿病足患者创面肉芽组织中Angiomotin表达的探讨

褚月颉 王鹏华 李代清 于德民

糖尿病足患者创面肉芽组织中Angiomotin表达的探讨

褚月颉 王鹏华 李代清 于德民

目的 测定Angiomotin（Amot）蛋白在糖尿病足溃疡患者创面肉芽组织中的表达，探讨高糖及缺血对Amot表达的影响及其与溃疡预后的关系。方法 选取天津医科大学代谢病医院糖尿病足病科住院的糖尿病足溃疡患者，均符合Wagner分级2～4级，共28例。根据溃疡侧踝肱指数（ABI）及HbA1c将糖尿病足溃疡患者分为 4组：A组：ABI≥0.7，HbA1c＜9%；B组：ABI≥0.7，HbA1c≥9%；C组：ABI＜0.7，HbA1c＜9%；D组：ABI＜0.7，HbA1c≥9%，每组7例。以同时期足部烧伤患者为非糖尿病、非缺血对照组。取各组患者足溃疡创面肉芽组织，应用Western印迹法测定Amot蛋白的表达，每例糖尿病足患者进行Wagner分级诊断并随访溃疡的预后情况。结果 比较4组糖尿病足患者年龄、性别、糖尿病病程、并发症、肾功能、血脂、超敏C反应蛋白，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。与对照组相比，p80-Amot在B组和D组表达明显减少（P均＜0.05）。与A组相比，p80-Amot在B组和D组表达明显减少（P均＜0.05）。p130-Amot在各组间的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。各组患者足溃疡的预后情况没有明显差异（P＞0.05）。结论 高血糖和缺血都会造成糖尿病足患者创面肉芽组织中Amot蛋白表达下降，其中高血糖的作用更显著。Amot蛋白表达与溃疡预后无明显相关。

Angiomotin；高糖；缺血；糖尿病足；溃疡预后

糖尿病足溃疡是与糖尿病相关的严重并发症之一，常导致患者疼痛和生活质量下降[1]。糖尿病足溃疡伤口愈合不良的机制非常复杂，其中在肉芽组织的形成过程中，血管新生障碍是导致糖尿病足溃疡伤口愈合不良的重要原因。Angiomotin（Amot）是2001年发现的一种血管生成抑素结合蛋白[2]。其异构体p80-Amot和p130-Amot分别在血管生成不同阶段发挥不同作用。体外实验表明，p80-Amot可增强细胞迁移并稳定管状结构，而p130-Amot则与肌动蛋白相关并影响细胞塑形[3]。作为一种调节血管新生的蛋白，Amot通过调节内皮细胞迁移和管状结构形成，在伤口愈合过程中发挥重要作用[4]。而Amot表达失调可能是糖尿病患者伤口愈合不良的发病原因。因此本研究测定了Amot在糖尿病足患者创面肉芽组织中的表达，旨在评价高血糖及缺血对Amot蛋白表达的影响，并进一步分析其与溃疡预后的关系，从而深入探讨其在糖尿病缺血性溃疡愈合的病理过程中发挥的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组 选取2011年2月至12月在天津医科大学代谢病医院糖尿病足病科住院的糖尿病足溃疡患者28例，其中男16例，女12例，平均年龄（63.64±9.59）岁。根据溃疡侧下肢缺血情况[踝肱指数（ABI）]及血糖控制情况（HbA1c）将患者分为 4组，每组 7例，A组：ABI≥0.7，HbA1c＜9%；B组：ABI≥0.7，HbA1c≥9%；C组：ABI＜0.7，HbA1c＜9%；D组：ABI＜0.7，HbA1c≥9%。另选取 7例同时期在天津武警医院烧伤科住院的足部烧伤患者作为非糖尿病、非下肢缺血的对照组。对照组患者平均年龄（59.24±11.57）岁，其中男 5例，女2例，7例患者两次随机血糖均＜6mmol/L，患肢ABI均大于1.0。经本院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 临床资料采集 各组患者由专业医师进行病史询问及体格检查，并详细记录于病历中。所有患者入院禁食12h，次日清晨采集肘静脉血，采用ImxAnalizer全自动生化仪测定尿素氮、肌酐、肝功能、血脂、血流变，用酶放大化学发光法测定HbA1c，采用免疫比浊法，应用芬兰Orion Dianostica公司试剂盒测定超敏C反应蛋白（hs-CRP），同时测定24 h尿微量白蛋白（UMA），并行ABI、双下肢血管彩色多普勒、心电图、眼底镜检查。空腹血糖为患者住院期间用德国拜耳公司血糖仪测定的所有空腹血糖的平均值。对照组患者同时采集相应的临床资料。

1.3 糖尿病足临床分级标准 采用Wagner分级法：0级，有发生足溃疡危险因素，目前无溃疡；1级，表浅溃疡，无感染；2级，较深溃疡，常合并软组织炎，无脓肿或骨的感染；3级，深部溃疡，有脓肿或骨髓炎；4级，局限性坏疽；5级，全足坏疽[5]。

1.4 治疗经过 28例糖尿病足溃疡患者入院后均选用胰岛素控制血糖，下肢缺血患者给予前列腺素E1（凯时）改善血运，神经病变患者给予神经妥乐平营养神经。根据足分泌物培养的药敏结果，结合临床症状选用1～2种敏感抗生素控制感染。足溃疡伤口每日用中药敷料换药，并根据创面情况进行必要的清创及窦道冲洗治疗。经上述综合治疗后，病情仍无法控制甚至继续恶化的患者及时进行截趾（肢）手术，术后延续上述治疗至创面愈合。对照组给予敏感抗生素控制感染，足溃疡予换药、清创及窦道冲洗治疗。

1.5 Western印迹测定Amot蛋白的表达 分别提取各组患者足溃疡伤口肉芽组织总蛋白，取等量蛋白（50μg）上样进行SDS-PAGE电泳（美国Bio-Rad公司），转膜，封闭，一抗4℃过夜，二抗室温孵育2 h，洗膜，显影。GAPDH为内参，Amot一抗工作浓度为1∶100，GAPDH一抗及Amot二抗工作浓度为1∶5 000，GAPDH二抗工作浓度为1∶4 000。X光片经图像扫描仪进行灰度扫描，以Amot与GAPDH的灰度比值表示Amot蛋白表达的相对值。

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0进行统计分析，正态分布的计量资料以±s表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。计数资料的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者临床资料的比较 各组患者年龄、性别、糖尿病病程、各种合并症情况、血脂、肾功能以及反映感染情况的hs-CRP差异均无统计学意义（P均＞0.05）。A组、C组空腹血糖和HbA1c低于B组、D组，差异有统计学意义（P＜0.01）。A组、B组ABI高于C组、D组，A组、B组彩色多普勒所测量的双下肢动脉最大狭窄率低于C组、D组，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。

2.2 各组糖尿病足溃疡患者Wagner分级情况 各组糖尿病足溃疡患者中除A组、C组各有1例Wagner2级患者外，其余均为Wagner3级、4级患者（表2），表明入选病例足溃疡程度较重，多数合并感染与局限性坏疽。

表1 各组糖尿病足患者临床资料的比较（±s）

表1 各组糖尿病足患者临床资料的比较（±s）

注：A组：ABI≥0.7，HbA1c＜9%；B 组：ABI≥0.7，HbA1c≥9%；C 组：ABI＜0.7，HbA1c＜9%；D 组：ABI＜0.7，HbA1c≥9%；ABI：踝肱指数；hs-CRP：超敏C反应蛋白；与B组相比，a P＜0.01，与C组相比，b P＜0.01，与D组相比，c P＜0.01

表2 各组糖尿病足患者Wagner分级情况[n（%）]

2.3 各组患者足溃疡伤口肉芽组织中Amot蛋白表达情况 与对照组相比，p80-Amot在B组、D组中表达明显减少，差异有统计学意义（P均＜0.05）。在各组糖尿病足溃疡患者中，与A组相比，p80-Amot在B组、D组患者中表达也明显减少，差异有统计学意义（P均＜0.05）。而p130-Amot在各组间的表达差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 Amot蛋白在各组患者足溃疡伤口肉芽组织中表达的差异

2.4 各组患者预后情况 各组足溃疡患者预后情况见表3。其中约有2/3的患者经治疗后，足溃疡创面愈合出院。约有1/3的患者经上述治疗后，溃疡创面仍未愈合，门诊继续换药治疗。C组有1例缺血严重的患者，创面长期不愈，患肢疼痛难忍而行高位截肢手术。各组患者预后差异无统计学意义（χ2=6.833，P=0.077）。

表3 各组患者预后情况[n（%）]

3 讨论

目前国内、外还没有更多关于Amot与伤口愈合方面的研究。鉴于Amot在促进血管新生过程中所起的重要作用，推测其在肉芽组织的形成过程中也是重要的促进因子。

本研究结果显示，对照组患者p80-Amot和p130-Amot表达量最多，在糖尿病足溃疡的各组患者中，A组表达量最多，而D组表达量最少。表明高糖和缺血均可能会引起Amot蛋白表达的下降，从而影响肉芽组织中新生血管的形成，进而造成溃疡伤口难以愈合。与对照组及A组相比，p80-Amot在血糖控制差的两组糖尿病足患者中的表达显著减少，表明高浓度的葡萄糖较缺血对p80-Amot蛋白表达的影响更大。而p130-Amot在各组间的表达差异无统计学意义。分析原因，可能是由于p130-Amot与p80-Amot在血管新生的不同阶段分别发挥不同的作用所致。有研究表明，p80-Amot可以增强细胞的迁移并稳定管状结构，而p130-Amot则与肌动蛋白相关并影响细胞的塑形[6]。Ernkvist等[6]研究分析了两种Amot异构体在小鼠胚胎视网膜血管生成过程中的表达，显示p80-Amot主要在细胞迁移阶段表达，而p130-Amot则主要在管状结构稳定和成熟阶段表达，进一步证实了二者相互作用，共同调节血管新生。本试验中，各组患者肉芽组织的取材时间主要掌握在肉芽组织生长的早期阶段。此时，足溃疡局部的感染情况已经基本得到控制，坏死组织被清除，肉芽组织新鲜丰富。而这一时期正是血管内皮细胞、成纤维细胞及上皮细胞大量募集到伤口周围，形成新生血管的时期。因此，在细胞迁移阶段表达的p80-Amot可能在此期发挥更主要的作用，表达量也更高。因此，高糖和缺血对它的影响可能会更大。而p130-Amot则主要在血管形成的后期表达。所以，在本研究中虽然也发现了高糖和缺血使得p130-Amot表达下降，但差异并没有统计学意义。进一步印证了Amot的两种拓扑异构体在血管新生的不同阶段各自发挥不同的作用。

在糖尿病足溃疡的各组患者间进一步分析Amot蛋白表达与溃疡预后的关系，各组患者足溃疡的预后情况并没有明显的差异。分析原因，可能为：（1）影响溃疡愈合的因素十分复杂，其中最重要的因素为感染。（2）Amot蛋白仅在伤口愈合过程中的某一个阶段发挥作用，而其他诸多的蛋白因子，如血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子的变化也会影响到伤口的愈合。本研究中只测定了Amot蛋白的表达情况，并未检测其他的蛋白因子。因此试验结果没有显示出Amot蛋白表达的差异与溃疡愈合的相关性。由此可见，糖尿病足溃疡难以愈合的机制非常复杂，还需进一步探索。

［1］Cornell S，DorseyVJ.Diabetes pharmacotherapy in 2012：considerations inmedication selection[J].Postgrad Med，2012，124（4）：84-94.

［2］Troyanovsky B，Levchenko T，Månsson G，et al.Angiomotin：an angiostatin binding protein that regulates endothelial cell migration and tube formation[J].JCell Biol，2001，152（6）：1247-1254.

［3］Bratt A，Birot O，Sinha I，et al.Angiomotin regulates endothelial cell-cell junctions and cell motility[J].JBiol Chem，2005，280（41）：34859-34869.

［4］Roy S，Khanna S，Rink C，et al.Characterization of the acute temporal changes in excisional murine cutaneous wound inflammation by screening of the wound-edge transcriptome[J].Physiol Genomics，2008，34（2）：162-184.

［5］许樟荣.糖尿病足病变诊断和治疗[J].中国糖尿病杂志，2001，9（3）：180-183.

［6］Ernkvist M，Birot O，Sinha I，et al.Differential roles of p80-and p130-angiomotin in theswitch betweenmigration and stabilization of endothelial cells[J].Biochim Biophys Acta，2008，1783（3）：429-437.

Angiomotin expression in wound granulation tissues from patients w ith diabetic foot

Chu Yuejie*，Wang Penghua，Li Daiqing，Yu Demin.*Department of Diabetes Mellitus，Tianjin Chinese Medicine Research Institute Affiliated Hospital，Tianjin 300120，China

Wang Penghua，Email:wph200000@163.com

Objective To determine the expression of Angiomotin（Amot）in wound granulation tissues from patients with diabetic foot，and investigate the effects of high glucose and ischemia on the expression of Amot and the relationship between Amot expression and ulcer prognosis.M ethods Twenty-eight diabetic inpatients with foot ulcers（Wagner's 2-4 grade）from the Departmentof Diabetic Foot in the Metabolic Diseases Hospital of Tianjin Medical University，were divided into four groups according to theiranklebrachialindex（ABI）andHbA1c：group A：ABI≥0.7，HbA1c＜9%；group B：ABI≥0.7，HbA1c≥9%；group C：ABI＜0.7，HbA1c＜9%and group D：ABI＜0.7，HbA1c≥9%，with 7 cases in each group.Patients with foot burns at the same time were included as non-diabetic and non-ischemic control group.Wound granulation tissues were sampled from these patients.Western blotwas used to determine the expression of Amot.Wagner'sgradewasassessed in each patientwith diabetic footand the patientswere followed up for the evaluation of ulcer prognosis.Results The age，gender，course of diabetes，complications，renal function，blood lipid，and sensitive C reactive protein were compared，but no significant difference were found between four diabetic foot groups（allP＞0.05）.Compared with control group，expression of p80-Amot in group B and group D were significantly reduced （allP＜ 0.05）.Compared with group A，expression of p80-Amot in group B and group D were also significantly reduced（allP＜ 0.05）.Therewas no significant difference in expression ofp130-Amotbetween groups（P＞0.05）.Therewasalso no significantdifference in ulcerprognosisbetween groups（P＞0.05）.Conclusions High glucoseand ischemia decrease the expression of Amot in wound granulation tissues in patients with diabetic foot，and high glucose has a more potent effect.There is no significant relationship between Amotexpression and ulcer prognosis.

Angiomotin；High glucose；Ischemia；Diabetic foot；Ulcerprognosis

（Int JEndocrinolMetab，2015，35：226-229）

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.04.003

天津市自然科学基金重点项目（10JCZDJC19800）；天津市卫生局科技基金（09KZ87）

300120 天津市中医药研究院附属医院糖尿病科（褚月颉）；300070 天津医科大学代谢病医院，卫生部激素与发育重点实验室（王鹏华，李代清，于德民）

王鹏华，Email:wph200000@163.com

2014-12-01）