pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒真核表达载体的构建与表达

马 旸，韩陈陈，李亦凡，汪 扬，魏 伟



◇技术与方法◇

pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒真核表达载体的构建与表达

马 旸，韩陈陈，李亦凡，汪 扬，魏 伟

GRK2-S670A突变体导入pIRES-EGFP真核表达载体，为寻找GRK2 磷酸化GPCR的位点提供研究基础。利用PCR定点突变试剂盒，获得pGEM-T-GRK2-S670A，用SalI/ApaI分别对pGEM-T-GRK2-S670A和EGFP-C3双酶切，构建EGFP-C3-GRK2-S670A，SalI/BamHI双酶切EGFP-C3-GRK2-S670A和pIRES-EGFP，得到pIRES-EGFP-GRK2-

pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒；重组质粒；细胞转染

G蛋白偶联受体激酶2(Gprotein-coupledreceptorkinase2，GRK2)在G蛋白偶联受体(G-protein-coupledreceptors，GPCRs)信号转导中起着重要作用[1]。GRK2结构域中不同的磷酸化位点影响GRK2的活性和功能[2-3]。MAPK磷酸化GRK2的Ser670，抑制GRK2 活性[4]，调节GPCR的脱敏和内化，在心力衰竭、高血压、类风湿关节炎等疾病的发生发展过程中起着重要作用[5-7]。研究[8]表明，GRK2在类风湿关节炎的免疫细胞和滑膜细胞中高表达，芍药苷(Paeoniflorin，Pae)可以下调GRK2的活性。因此GRK2作为心衰、高血压、类风湿关节炎等疾病的治疗靶点，为靶向药物的研发提供了新的方向。为了探讨药物作用GRK2的活性位点，该研究构建了pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒真核表达载体，并使其在HEK293细胞中成功表达。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 E.coliDH5α菌株为安徽医科大学临床药理所保存；pIRES-EGFP载体、pEGFP-C3载体购自上海北诺生物科技有限公司；pGEM-T-GRK2-wt质粒为本课题组前期构建。

1.1.2 试剂和仪器 定点突变试剂盒、PrimerStarDNA聚合酶、SalI、BamHI、DNAMarkerDL10 000(美国Takara公司)；ApaI(美国ThermoScientific公司)；T4DNA连接酶(美国Promega公司)；Lipofectamine3000Reagent(美国Invitrogen公司)；胶回收试剂盒(中国TIANGEN公司)； 质粒小提试剂盒(美国OmegaBio-Tek公司)；小鼠抗人GRK2 抗体(美国Abcam公司)；PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)；Tanon1600全自动数码凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；IX-70荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；2306-2型CO2培养箱(美国SHELLAB公司)。

1.2 方法

1.2.2pGEM-T-GRK2-S670A质粒的获取 以pGEM-T-GRK2-wt为模板，利用导入变异点的引物进行PCR反应后，对PCR产物进行末端平滑化及5′磷酸(P)化处理，再用高效连接试剂LigationSolutionI进行自身连接(环化反应)，然后转化、提取突变体DNA，即pGEM-T-GRK2-S670A。

1.2.3 重组真核表达质粒pIRES-EGFP-GRK2-S670A的构建EGFP-C3载体和pGEM-T-GRK2-S670A质粒经SalI、ApaI双酶切，凝胶回收，在T4DNA连接酶作用下，连接EGFP-C3与GRK2-S670A，4 ℃连接过夜。经过转化、筛选、扩增，质粒提取，酶切鉴定，获得EGFP-C3-GRK2-S670A突变质粒。再将pIRES-EGFP载体和EGFP-C3-GRK2-S670A突变质粒经SalI、BamHI双酶切，连接、转化、筛选、扩增，质粒提取，酶切鉴定，获得pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒。

1.2.4HEK293细胞培养和转染HEK293细胞培养于含 10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养 。消化细胞后，于6孔板内接种2×105个细胞，待细胞长至80%～90%进行转染 。转染方法根据转染试剂说明书提供的操作步骤进行。

1.2.5 蛋白提取与Westernblot检测 细胞转染48h后，收集并清洗细胞，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30min，4 ℃、13 200r/min离心15min，吸取上清液加入上样缓冲液，混匀后沸水浴中煮10min，经过上样、电泳、转膜、封闭等操作后，用GRK2抗体，4 ℃孵育过夜，第2天经过洗膜和二抗敷育后置于ImageQuantLAS4000荧光及化学发光成像系统中曝光成像。

2 结果

2.1pGEM-T-GRK-S670A的扩增 以pGEM-T-GRK2-wt质粒为模板，以GRK2-670上游引物、GRK2-670下游引物PCR扩增后，1%琼脂糖电泳结果表明，产物条带均与预期的大小一致，即线性pGEM-T-GRK-S670A目的片段(约5 000bp)，见图1A。将PCR扩增产物切胶的回收产物(图1B)进行末端平滑化及5′磷酸化处理，再用高效连接试剂LigationSolutionI进行自身连接(环化反应)，经双酶切初步鉴定，得到线性GRK-S670A片段(2 067bp)和线性pGEM-T片段(3 015bp)，见图1C。

2.2pEGFP-C3-GRK2-S670A突变质粒的构建和鉴定 将pGEM-T-GRK2-S670A突变质粒和pEGFP-C3载体用SalI和ApaI行双酶切，1%的琼脂糖凝胶电泳上检测，切胶回收，得到线性GRK-S670A片段(2 067bp)和线性pEGFP-C3 片段(4 700bp)。将构建的pEGFP-C3-GRK2-S670A突变质粒，经酶切鉴定，得到2 067bp的GRK-S670A片段和4 700bp的线性pEGFP-C3 片段，见图2。

图1 PCR扩增产物及酶切鉴定

M：Marker；A：pGEM-T-GRK-S670APCR扩增产物；1：PCR扩增的线性pGEM-T-GRK-S670A；B：PCR产物(pGEM-T-GRK-S670A)切胶回收；1：PCR扩增产物切胶回收得到的线性pGEM-T-GRK-S670A；C：PCR产物(pGEM-T-GRK-S670A)双酶切鉴定；1：SalI和ApaI双酶切pGEM-T-GRK-S670A质粒

图2 pEGFP-C3-GRK2-S670A重组突变质粒的酶切及鉴定

M:Marker;A：pGEM-T-GRK-S670A质粒和pEGFP-C3质粒双酶切回收产物；1、2：SalI和ApaI双酶切pGEM-T-GRK-S670A突变质粒，切胶回收；3、4：SalI和ApaI双酶切pEGFP-C3载体，切胶回收；B：pEGFP-C3-GRK2-S670A重组突变质粒双酶切鉴定；1、2、3、4：SalI和ApaI双酶切pEGFP-C3-GRK2-S670A突变质粒

2.3pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒的构建和鉴定 将EGFP-C3-GRK2-S670A突变质粒和pIRES-EGFP载体用SalI和BamHI进行双酶切后，得到线性GRK-S670A片段(2 067bp)和pIRES-EGFP片段(5 200bp)，见图3A。将构建的pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒，经SalI/BamHI双酶切鉴定，得到线性GRK-S670A片段(2 067bp的)和线性pIRES-EGFP片段(5 200bp)，见图3B，基因测序结果经过序列比对正确，表明载体构建成功。

图3 pIRES-EGFP-GRK2-S670A重组突变质粒的酶切及鉴定

M:Marker;A：pEGFP-C3-GRK2-S670A质粒和pIRES-EGFP质粒双酶切回收产物；1：SalI和BamHI双酶切pEGFP-C3-GRK2-S670A，切胶回收；2：SalI和BamHI双酶切pIRES-EGFP，切胶回收；B：pIRES-EGFP-GRK2-S670A重组突变质粒酶切鉴定；1、2：SalI和BamHI双酶切pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒

2.4 荧光显微镜观察pIRES-EGFP-GRK2-S670A重组蛋白表达 在6孔板中接种人源HEK293细胞，转染pIRES-EGFP-GRK2-wt和pIRES-EGFP-GRK2-S670A重组突变质粒，培养48h后，在荧光显微镜下观察可见绿色荧光蛋白的表达，见图4。

图4 荧光显微镜下观察重组质粒的表达 ×40

A：重组质粒pIRES-EGFP-GRK2-wt转染HEK293细胞48h；B：pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒转染HEK293细胞48h

2.5Westernblot法检测pIRES-EGFP-GRK2-S670A重组蛋白表达 转染空载体pIRES-EGFP-ctr、pIRES-EGFP-GRK2-wt和pIRES-EGFP-GRK2-S670A到HEK293细胞48h后，Westernblot结果表明转染GRK2-wt和GRK2-S670A的质粒可见EGFP-GRK2重组蛋白表达，同时由于使用GRK2的抗体进行检测，结果中也同时可见内源GRK2的表达。见图5。

图5 Western blot法检测GRK2的重组蛋白在HEK293细胞中的表达

A：pIRES-EGFP-GRK2-wt；B：pIRES-EGFP-GRK2-S670A；C：pIRES-EGFP-ctr

3 讨论

人源GRK2由689个氨基酸残基组成，有3个重要的结构域：N末端、催化结构域、C末端[9]。N末端约有185个氨基酸组成的结构域，可以结合Gα/11、Gβγ、小窝蛋白、钙调蛋白等，含有蛋白激酶C(PKC)的磷酸化位点(Ser29)[10]及c-Src的磷酸化位点(Tyr19、86、92)[11]；催化结构域约有270个氨基酸组成，有S-亚硝基化位点(Cys340)以及决定GRK2催化活性的重要位点(Lys220)[12]；C末端约有230个氨基酸组成，可以结合PI3K、AKT、PIP2、钙调蛋白等，含有细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化位点(Ser670)及蛋白激酶A(PKA)的磷酸化位点(Ser685)。GRK2 的Cys340发生S-亚硝基化可抑制GRK2的活性[13]，ERK磷酸化GRK2的Ser670也可抑制GRK2的活性[4]，而PKA磷酸化GRK2的Ser685可促进GRK2的活化[14]。对参与GRK2活性的主要位点进行点突变，构建相应的突变质粒并在真核细胞中稳定表达，对于探讨小分子化合物影响GRK2活性的机制有主要实验价值。

定点突变技术是分子生物学和蛋白质工程中常用的重要技术之一，是体外特异性取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术。通过定点突变技术可以有目的地改变DNA序列中的碱基，使之符合应用需求。常用方法有盒式取代诱导、常寡核苷酸引物诱变及PCR定点诱变等。PCR定点诱变因具有突变效率高、简便快捷、成本低及可在任何位点引入突变的优点，是DNA靶片段产生突变的首选方法。根据PCR定点诱变的技术原理，本课题组针对GRK2，分别设计带有突变碱基的诱变引物，以pGEM-T-GRK-wt为模板，通过双酶切成功获得了GRK2-S670A突变体的cDNA片段，再将这些突变的cDNA片段分别连pIRES-EGFP中，其中重组突变质粒pIRES-EGFP-GRK2-S670A转染入真核细胞以表达带有绿色荧光蛋白标记的GRK2 突变体。本实验将pIRES-EGFP-GRK2-wt和pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒分别转染入HEK293细胞后培养48h，荧光显微镜观察显示野生型与突变型在细胞定位方面并无明显差异，两者均为全细胞分布。Westernblot检测显示，重组蛋白与内源蛋白比较，条带位置略有升高，这是因为重组蛋白的分子量多出一个EGFP的分子量。

综上所述，pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒真核表达载体的成功构建及其在HEK293细胞中成功表达，将为探讨药物作用GRK2的活性位点奠定基础。

[1]WatariK,NakayaM,KuroseH.MultiplefunctionsofGprotein-coupledreceptorkinases[J].JMolSignal, 2014, 9(1):1.

[2]MushegianA,GurevichVV,GurevichEV.TheoriginandevolutionofGprotein-coupledreceptorkinases[J].PLoSOne, 2012, 7(3):e33806.

[3]PenelaP,MurgaC,RibasC,etal.ThecomplexGprotein-coupledreceptorkinase2 (GRK2)interactomeunveilsnewphysiopathologicaltargets[J].BrJPharmacol, 2010, 160(4): 821-32.

[4]NoguésL,SalcedoA,MayorFJr,etal.Multiplescaffoldingfunctionsof{beta}-arrestinsinthedegradationofGprotein-coupledreceptorkinase2[J].JBiolChem, 2011, 286(2):1165-73.

[5]HuangZM,GaoE,ChuprunJK,etal.GRK2intheheart:aGPCRkinaseandbeyond[J].AntioxidRedoxSignal, 2014, 21(14):2032-43.

[6]SantulliG,TrimarcoB,IaccarinoG.G-protein-coupledreceptorkinase2andhypertension:molecularinsightsandpathophysiologicalmechanisms[J].HighBloodPressCardiovascPrev, 2013, 20(1):5-12.

[7]StevensonNL,Martin-MartinB,FreemanJ,etal.Gprotein-coupledreceptorkinase2moderatesrecruitmentofTHP-1cellstotheendotheliumbylimitinghistamine-invokedWeibel-Paladebodyexocytosis[J].JThrombHaemost, 2014, 12(2):261-72.

[8]ChenJY,WuHX,WeiW,etal.Paeoniflorininhibitsproliferationoffibroblast-likesynoviocytesthroughsuppressingG-protein-coupledreceptorkinase2[J].PlantaMed, 2012, 78(7):665-71.

[9]EvronT,DaigleTL,CaronMG.GRK2:multiplerolesbeyondGprotein-coupledreceptordesensitization[J].TrendsPharmacolSci, 2012, 33(3):154-64.

[10]MalhotraR,D′SouzaKM,StaronML,etal.Galpha(q)-mediatedactivationofGRK2bymechanicalstretchincardiacmyocytes:theroleofproteinkinaseC[J].JBiolChem, 2010, 285(18):13748-60.

[11]HuangJ,NalliAD,MahavadiS,etal.InhibitionofGαiactivitybyGβγismediatedbyPI3-kinase-γ-andcSrc-dependenttyrosinephosphorylationofGαiandrecruitmentofRGS12[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol, 2014, 306(9):G802-10.

[12]BeautraitA,MichalskiKR,LopezTS,etal.MappingtheputativeGprotein-coupledreceptor(GPCR)dockingsiteonGPCRkinase2:insightsfromintactcellphosphorylationandrecruitmentassays[J].JBiolChem, 2014, 289(36):25262-75.

[13]HuangZM,GaoE,FonsecaFV,etal.ConvergenceofGprotein-coupledreceptorandS-nitrosylationsignalingdeterminestheoutcometocardiacischemicinjury[J].SciSignal, 2013, 6(299):ra95.

[14]MurthyKS,MahavadiS,HuangJ,etal.PhosphorylationofGRK2byPKAaugmentsGRK2-mediatedphosphorylation,internalization,anddesensitizationofVPAC2receptorsinsmoothmuscle[J].AmJPhysiolCellPhysiol, 2008, 294(2):C477-87.

Construction and expression of the eukaryotic expressing vector of pIRES- EGFP- GRK2- S670 A mutants recombinant plasmids

MaYang,HanChenchen,LiYifan,etal

(Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University,Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine, Ministry of Education, Anhui Collaborative Innovation Center of Anti-inflammatory and Immune Medicine, Hefei 230032)

TheS670AmutationofGRK2wasimportedtothepIRES-EGFPeukaryoticexpressionvector,providingresearchfoundationofGRK2phosphorylationGPCRsite(s).TaKaRamutanBESTKitwasadoptedtoobtainpGEM-T-GRK2-S670A.pGEM-T-GRK2-S670AandEGFP-C3plasmidsweredouble-digestedbySalI/ApaI,toconstructEGFP-C3-GRK2-S670Aplasmid.ThenEGFP-C3-GRK2-S670AandpIRES-EGFPweredouble-digestedbySalI/BamHI,inordertobuildacompleteeukaryoticexpressionplasmidpIRES-EGFP-GRK2-S670A.TheplasmidwastransfectedinHEK293cellsandrecombinantproteinwasdetectedwithfluorescencemicroscopeandWesternblotassays.TheresultsofdigestionandDNAsequencingoftheplasmidwerecorrect,eukaryoticexpressedvectorpIRES-EGFP-GRK2-S670Amutantrecombinantplasmidwassuccessfullyconstructed,andtherecombinantproteinwasexpressedinHEK293celllinesaftercelltransfection,whichmaybethefoundationofthefollowingresearch.

IRES-EGFP-GRK2-S670Amutantsplasmids;recombinantplasmids;celltransfection

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.034.html

2016-05-30接收

国家自然科学基金(编号：81502123、81330081)；安徽省自然科学基金(编号：1308085QH130)；安徽省高等学校省级自然科学研究项目(编号：KJ2014A119)

安徽医科大学临床药理研究所、抗炎免疫药物教育部重点实验室、抗炎免疫药物安徽省协同创新中心，合肥 230032

马 旸，女，博士，讲师；

魏 伟，男，博士，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：wwei@ahmu.edu.cn

S670A。将构建的质粒转染HEK293细胞，荧光显微镜下观察和Westernblot法检测融合蛋白的表达。酶切鉴定显示pIRES-EGFP-GRK2-S670A质粒条带大小符合，测序结果正确，成功构建pIRES-EGFP-GRK2-S670A真核表达质粒，转染HEK293 细胞后可见融合蛋白表达，为后续研究奠定基础。

R394.112；R394.34

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.034