徐州猫源弓形虫株基因型及其毒力研究

朱长东，程维晟，罗庆礼，沈继龙



徐州猫源弓形虫株基因型及其毒力研究

朱长东1,2，程维晟1，罗庆礼1，沈继龙1

目的 了解猫源弓形虫株基因型和毒力，为研究其致病机制奠定基础。方法 自江苏徐州诱捕采集40只流浪家猫，昆明小鼠腹腔接种分离弓形虫；采用PCR-RFLP法对10个基因分型位点(SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1及Apico)进行PCR扩增，扩增产物用相应的限制性核酸内切酶水解后观察分析电泳图谱；将分离的虫株分别感染SPF级BALB/c小鼠和昆明鼠，观察其存活时间和存活率，分析毒力强弱。选取弓形虫的毒力相关效应分子ROP16和GRA15，PCR扩增出基因序列，比较其多态性。结果 共获得6株猫源弓形虫虫株，基因分型结果显示，两株为Chinese1型(即ToxoDB#9型)，4株为ToxoDB#205型；此6株弓形虫虫株对BALB/c小鼠和昆明鼠均有较强的毒性，两种小鼠分别在感染后5～7d和9～12d均100%死亡。毒力相关基因GRA15和ROP16的分析显示，Chinese1型虫株为GRA15Ⅱ和ROP16Ⅰ/Ⅲ型，ToxoDB#205型虫株为GRA15Ⅱ和ROP16Ⅱ型。结论 徐州地区猫源弓形虫虫株具有有限遗传多态性，且均为强毒的虫株。ToxoDB#205型虫株的主要毒力效应分子ROP16Ⅱ不同于Chinese1型虫株，这一毒力相关基因的多态性与其毒力的关系尚待深入研究。

弓形虫；基因型；毒力；GRA15；ROP16

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性有核细胞内寄生的机会致病性原虫，全球广泛传播，可以感染几乎所有温血动物，严重危害人类健康和畜牧业生产。世界各地人和动物体内分离的弓形虫株基因型具有丰富的遗传多态性和地域差异，且在不同地域具有不同的优势基因型[1]。近年来的研究[2]表明，流行于我国不同地区的动物源性弓形虫株具有有限的遗传多态性，且优势基因型为Chinese1型。弓形虫侵入宿主细胞分泌的多态性效应分子主要包括棒状体蛋白ROPs家族如ROP16和ROP18等，以及致密颗粒蛋白GRA家族如GRA15、GRA5和GRA3等。其中研究较多的有ROP16和GRA15。该研究采用PCR-RFLP法对徐州猫源弓形虫株进行基因分型，分析该地区弓形虫株基因型和毒力及其毒力相关分子ROP16和GRA15的多态性，为深入探讨其基因型相关的毒力效应分子多态性与虫株致病性的关系，以及完善我国弓形虫株的遗传资源库，提供重要理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和参考虫株 成年流浪猫40只，采自江苏徐州，雌雄不限，经麻醉后无痛处死，取全部脑组织进行弓形虫虫株分离。4～6 周龄，雌性SPF级BALB/c小鼠60只，昆明鼠180只，均购自安徽省实验动物中心，室温下标准饲养。3种参考虫株DNA为typeⅠ型(GT1)、typeⅡ型(PTG)和typeⅢ型(CTG)，由美国田纳西大学微生物教研室苏春雷教授惠赠。

1.2 主要试剂和仪器DNA提取试剂盒购自原平皓(天津)生物技术有限公司；PCR预混液购自生工生物工程(上海)有限公司；琼脂糖购自西班牙GENE公司；限制性核酸内切酶购自美国Ferments公司；PCR纯化试剂盒购自Axygen公司；基因分型引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；温度梯度基因扩增仪购自德国MIONETRA公司；电泳仪和电泳槽购自美国BIO-RAD公司；凝胶成像系统购自江苏省捷达科技发展有限公司。

1.3 猫源弓形虫的分离 按照参考文献[3]方法，无菌取猫脑组织50g，加入125ml无菌生理盐水，组织匀浆器搅碎制备形成匀浆液；按照1 ∶1的比例，加入37 ℃预热的盐酸胃蛋白酶消化液，置恒温摇床，37 ℃、150r/min，消化1h。以1 200r/min将滤液离心10min，弃上清液，加入约20ml的PBS(PH7.2)，1 200r/min离心10min，弃上清液；氨苄西林和链霉素灭菌生理盐水稀释，制成1 ∶10 混悬液(氨苄西林1 000U/ml、链霉素100μg/ml)。将上述组织悬液腹腔接种昆明小鼠3只，每只小鼠接种1ml。每天观察，如小鼠有竖毛、弓背、厌食等明显表现时，收集腹腔灌洗液涂片，镜检。如果接种小鼠存活，待40d后，取脑组织压片镜检。

1.4 弓形虫DNA的提取 分别取弓形虫感染小鼠腹水，PBS洗涤3次，离心收集速殖子后，用DNA提取试剂盒提取弓形虫基因组DNA，于-20 ℃保存备用。

1.5 弓形虫株RFLP-PCR基因分型 参照文献[4]中的10个分型标志物基因特异性引物SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1及Apico，以本次分离的虫株及参考虫株的基因组DNA为模版，扩增上述10个基因片段。反应体系如下：弓形虫DNA模板1.5μl，上下游引物各1μl，PCRPremixTaq25μl，总体积为50μl。扩增条件：94 ℃预变性5min，94 ℃变性40s，60 ℃退火40s，72 ℃延伸60s，共35个循环，最后72 ℃延伸10min。PCR结束后，1%琼脂糖凝胶观察反应结果。纯化PCR产物，并用相应的限制性核酸内切酶酶切，酶切后产物采用2.5%琼脂糖凝胶电泳观察并记录结果。

1.6 虫株的毒力检测 分离的弓形虫株感染昆明小鼠，出现明显症状后收集腹水，按照本实验室的常规方法[5]，PBS洗涤3次后经梯度离心法纯化速殖子，纯化后速殖子经PBS稀释至2ml置显微镜下计数，按1×103个/只分别腹腔感染SPF级BALB/c小鼠和昆明鼠，每组各10只。逐日观察小鼠状态并计算死亡率和存活时间；若实验小鼠长期存活，则至感染后45d，麻醉颈椎脱臼处死各组存活小鼠，脑组织压片观察包囊是否形成。累积死亡率(%)=死亡小鼠个数/感染小鼠个数×100%。

1.7 毒力相关基因分析 依据基因库中弓形虫虫株的毒力相关基因ROP16和GRA15的全长，设计PCR扩增引物，对分离的虫株进行PCR扩增，扩增产物纯化后，送生工生物工程(上海)有限公司进行测序，根据测序结果，比较ROP16和GRA15的核苷酸序列差异。

1.8 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行分析。根据小鼠感染不同弓形虫株的存活时间、死亡率，采用χ2检验对小鼠感染各虫株反应有无差异，不同虫株两两检验。

2 结果

2.1 弓形虫基因分型 上述40只流浪猫共分离出6株弓形虫株。采用通用的10个基因分型遗传位点，对此6株猫源弓形虫株(按猫的编号分别为TgCtxz9、34、37、38、39、40)进行基因分型，共发现Chinese1型(即ToxoDB#9型)2株，ToxoDB#205型4株。见图1、表1。在SAG3位点，虫株TgCtxz34和TgCtxz38与Ⅲ型相同，而虫株TgCtxz9、TgCtxz37、TgCtxz39和TgCtxz40与I型相同；在c29-2位点，虫株TgCtxz34和TgCtxz38与Ⅲ型相同，而TgCtxz9、TgCtxz37、TgCtxz39和TgCtxz40与II型相同。这一谱型显示虫株TgCtxz34和TgCtxz38为Chinese1型，而虫株TgCtxz9、TgCtxz37、TgCtxz39和TgCtxz40为ToxoDB#205型。

图1 2.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定SAG3和c29-2基因PCR产物酶切结果

M：50bpDNALadderMarker；A：SAG3；B：c29-2；Ⅰ：GT1；Ⅱ：PTG；Ⅲ：CTG；1：TgCtxz9；2：TgCtxz34；3：TgCtxz37；4：TgCtxz38；5：TgCtxz39；6：TgCtxz40

2.2 虫株毒力 每个分离虫株取1×103速殖子经腹腔接种BALB/c小鼠后，第5天开始出现竖毛、腹水、抽搐等明显症状，至第7 天完全死亡。昆明小鼠腹腔接种同样数量速殖子后，存活时间略长于BALB/c小鼠，但在12d之内亦全部死亡(表2)。实验中未发现小鼠能长期存活的成囊虫株。各虫株之间的毒力差异无统计学意义。在两种品系小鼠之间，感染同一虫株的昆明小鼠存活时间明显长于BALB/c小鼠(P<0.01)，表现出同一虫株对不同品系的小鼠有着不同的毒力。

表1 中国徐州6株猫源性弓形虫株基因分型

表2 小鼠分别感染6株弓形虫株后存活时间比较

2.3 毒力相关基因 通过PCR扩增6株弓形虫的毒力相关分子GRA15和ROP16，并测序。结果显示，Chinese1型2个虫株携带GRA15Ⅱ和ROP16Ⅰ/Ⅲ；而ToxoDB#205型4个虫株携带GRA15Ⅱ和ROP16Ⅱ，表现出明显的差异性(表3)。

表3 毒力相关基因GRA15和ROP16多态性分析

3 讨论

近年来，随着对于弓形虫广泛深入的研究，其基因型也得到充分的认识，研究[1]表明，世界各地的弓形虫株基因型具有丰富的遗传多态性，可分成A～F6个进化枝(Clade)。目前已知全球人兽分离的弓形虫基因型具有地域的显著变异。北美和欧洲主要分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3个基因型[6]。南美洲的弓形虫基因型十分复杂，大致包括BrⅠ～Ⅳ等4个基因型[7]。我国的弓形虫基因分型及其与致病的关系研究较晚。本实验室以及国内其他学者的研究[5,8-10]显示，相对于世界各地弓形虫虫株的多态性，流行于中国的弓形虫虫株具有有限的遗传多态性，且以Chinese1型(ToxoDB#9)为其优势基因型，约占总分离株的70%以上。此外，尚有少数其他的基因型，如：ToxoDB#1(TypeⅡ型)、ToxoDB#3、ToxoDB#10(TypeⅠ型)、ToxoDB#205和ToxoDB#213等。本次的实验结果显示，徐州流行的猫源弓形虫虫株主要有两种基因型即Chinese1型和ToxoDB#205型，与既往研究[2]结果相符。

研究[11]显示，弓形虫不同的基因型对宿主细胞的入侵过程具有显著差异。弓形虫入侵宿主细胞其实是一系列虫体分泌蛋白协助肌动蛋白动作入侵的过程，分泌的蛋白包括ROPs、GRAs、MICs、RONs等多种效应分子，主要由致密颗粒(densegranule)、棒状体(rhoptry)与微线体(microneme)这3类分泌器分泌，这些效应分子在虫体识别、黏附、入侵、PVM形成、增殖、出胞以及诱导宿主免疫应答，甚至感染结局等方面起到关键的作用，且ROPs和GRAs具有多态性[12-13]。

GRAs家族蛋白成员GRA15与ROPs家族的蛋白成员ROP16具有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶样活性，并同时具有基因型或虫株的多态性[11]。其中I型与III型虫株的ROP16Ⅰ/Ⅲ高度同源，可以限制Th1型免疫反应，抑制IFN-γ的表达和IRGs的募集，导致虫体过度增殖甚至宿主死亡；而Ⅱ型虫株的ROP16Ⅱ则无此作用。Ⅱ型虫株的GRA15Ⅱ基因较Ⅰ、Ⅲ型C末端具有完整的AA312～550的片段，可以促进宿主细胞IL-12分泌，可以诱导巨噬细胞向经典途径激活的巨噬细胞(classicactivatedmacrophages，M1) 极化，抑制精氨酸合成，高表达诱导性NO合酶(iNOS)，ROS与NO释放增加，杀伤虫体，并且活化NK、Th1和Th17细胞，扩大炎症反应，使宿主获得强力免疫力，而Ⅰ、Ⅲ型虫株的GRA15Ⅰ/Ⅲ则无此作用。

本次的研究显示，流行于徐州的弓形虫Chinese1型虫株携带有多态性的GRA15Ⅱ基因和ROP16Ⅰ/Ⅲ基因，和既往的研究[2]结果一致。提示其毒力和致病性既不同于欧美的Ⅰ型虫株，也不同于Ⅱ型虫株，其毒力相关分子的功能及作用机制值得深入研究。而ToxoDB#205虫株不同于Chinese1，前者携带有GRA15Ⅱ基因和ROP16Ⅱ基因，与Ⅱ型虫株一致。本实验中感染小鼠均在急性期死亡，两个基因型虫株感染同品系小鼠后死亡时间未见显著差异，提示均为强毒虫株。因此，我国流行的弓形虫不同基因型的虫株毒力上存在其他毒力相关分子。

本研究对弓形虫虫株的采集和基因分型，丰富了我国现有的弓形虫虫株基因型的数据，提示不仅有我国优势基因型Chinese1型流行，而且ToxoDB#205也有广泛的分布，同时也为进一步探讨我国弓形虫虫株基因资源研究和弓形虫基因型相关的致病机制的研究提供了理论依据和实验依据。GRA15Ⅱ和ROP16Ⅰ/Ⅲ诱导宿主的差异性免疫应答特点及机制有待进一步研究。

[1]SuC,KhanA,ZhouP,etal.GloballydiverseToxoplasma gondiiisolatescomprisesixmajorcladesoriginatingfromasmallnumberofdistinctancestrallineages[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2012, 109(15): 5844-9.

[2]WangL,ChenH,LiuD,etal.GenotypesandmousevirulenceofToxoplasma gondiiisolatesfromanimalsandhumansinChina[J].PLoSOne, 2013, 8(1):e53483.

[3]DubeyJP.RefinementofpepsindigestionmethodforisolationofToxoplasma gondiifrominfectedtissues[J].VetParasitol, 1998, 74(1): 75-7.

[4]FerreiraIM,VidalJE,deMattosCdeC,etal. Toxoplasma gondiiisolates:multilocusRFLP-PCRgenotypingfromhumanpatientsinSaoPauloState,Brazilidentifieddistinctgenotypes[J].ExpParasitol, 2011, 129(2): 190-5.

[5]ChenZW,GaoJM,HuoXX,etal.GenotypingofToxoplasma gondiiisolatesfromcatsindifferentgeographicregionsofChina[J].VetParasitol, 2011, 183(1-2): 166-70.

[6]BladerIJ,SaeijJP.CommunicationbetweenToxoplasma gondiianditshost:impactonparasitegrowth,development,immuneevasion,andvirulence[J].APMIS, 2009, 117(5-6): 458-76.

[7]RajendranC,SuC,DubeyJP.MoleculargenotypingofToxoplasma gondiifromCentralandSouthAmericarevealedhighdiversitywithinandbetweenpopulations[J].InfectGenetEvol, 2012, 12(2): 359-68.

[8] 孟德娣,王 林,楼 研,等. 贵州猫源弓形虫株基因分型及毒力研究[J]. 中国人兽共患病学报,2014,30(2):150-4.

[9]ZhouP,SunXT,YinCC,etal.GeneticcharacterizationofToxoplasma gondiiisolatesfrompigsinsouthwesternChina[J].JParasitol, 2011, 97(6): 1193-5.

[10]沈继龙,王 林.弓形虫的基因型及其主要效应分子的致病机制[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2015,33(6):429-35.

[11]HunterCA,SibleyLD.ModulationofinnateimmunitybyToxoplasma gondiivirulenceeffectors[J].NatRevMicrobiol, 2012, 10(11):766-78.

[12]MercierC,Cesbron-DelauwMF. Toxoplasmasecretorygranules:onepopulationormore?[J].TrendsParasitol, 2015, 31(2): 60-71.

[13]SaeijJP,BoyleJP,CollerS,etal.Polymorphicsecretedkinasesarekeyvirulencefactorsintoxoplasmosis[J].Science, 2006, 314(5806): 1780-3.

Genotypes and virulence of Toxoplasma gondii isolates from cats in Xuzhou

ZhuChangdong1, 2,ChengWeisheng1,LuoQingli1,etal

(1Dept of Microbiology and Parasitology of Anhui Medical University, Anhui Provincial Laboratory of Pathogen Biology, Anhui Key Laboratory of Zoonoses, Hefei 230032;2Dept of Clinical Laboratory of Lujiang People′s Hospital, Lujiang 231500)

Objective To investigate the genotype and virulence related effectors of theToxoplasmagondiiisolates from cat in Xuzhou.Methods The strains ofT.gondii, which had been isolated from Xuzhou in Eastern China, were genotyped with PCR-RFLP at 10 genetic markers. At the same time, the virulence was analyzedviaobserva-

Toxoplasmagondii; genotyping; virulence; GRA15; ROP16

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.006.html

2016-06-12接收

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(编号：2010CB530001)；国家自然科学基金(编号：81471983)

1安徽医科大学病原生物学教研室、安徽病原生物学省级实验室、人兽共患病安徽省重点实验室，合肥 230032

2安徽省庐江县人民医院检验科，庐江 231500

朱长东，男，硕士研究生，主管检验师；

沈继龙，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：shenjilong53@126.com；

罗庆礼，男，助理研究员，责任作者，E-mail：luoqingli@ahmu.edu.cn

R382.5

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.006

tion of the survival time and survival rate after techyzoites inoculation, and BALB/c mice and Kunming mice were infected respectively withT.gondii. The coding sequences of virulence related effectors of GRA15 and ROP16 were amplified by PCR, and the polymorphism was compared.Results A total of 6 strains ofT.gondiiwere isolated from cats, and genotyping results showed that 2 strains belonged to type Chinese 1(ToxoDB#9) and 4 strains were found to be ToxoDB#205. All of the six isolates exhibited strong virulence, leading to 100% death after 5～7 days in BALB/c mice and 9～12 days in Kunming mice post-infection. The analysis of virulence related GRA15 and ROP16 genes showed that the Chinese 1 strains possessed the polymorphic GRA15Ⅱand ROP16Ⅰ/Ⅲ, whereas the ToxoDB#205 strains carried GRA15Ⅱand ROP16Ⅱ.Conclusion TheT.gondiiisolates collected from Xuzhou have limited genotypes which share the polymorphic virulence effectors.