ANXA5单核苷酸多态性rs2306413在中国汉族人群中不明原因性复发性流产的相关性研究

刘云云，向卉芬，曹云霞



ANXA5单核苷酸多态性rs2306413在中国汉族人群中不明原因性复发性流产的相关性研究

刘云云，向卉芬，曹云霞

目的 探讨膜联蛋白A5(ANXA5)基因内含子2单核苷酸多态性(SNP)位点rs2306413与中国汉族人群不明原因性复发性流产(URSA)之间的关系。方法 采用病例-对照研究的方法，对213例URSA患者和170例健康对照者ANXA5基因内含子2区域的SNP位点rs2306413进行等位基因频率和基因型分布分析。数据检验方法采用Pearsonχ2检验。结果rs2306413的等位基因在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P=0.006)；rs2306413在病例组和

不明原因性复发性流产；膜联蛋白A5；单核苷酸多态性；关联分析

复发性流产(recurrentspontaneousabortion,RSA)一般被定义为：与同一配偶连续发生的2次或2次以上的自然流产[1]。RSA是临床上比较常见的妊娠并发症，发生率大约为全部妊娠女性的1%～5%[2]。其病因复杂多样，目前已知的病因包括染色体异常、生殖道解剖异常、内分泌和免疫因素、感染因素等。流行病学研究[3]显示，约有近半数的RSA患者，即便对上述已知的病因进行全面、仔细的排查后，仍不能确定其发病原因。这部分患者则被称为不明原因性复发性流产(unexplainedrecurrentspontaneousabortion，URSA)。RSA有较高的发病率，而临床上目前尚没有统一有效的治疗方法，给育龄期妇女的身心及其家庭带来了极大的打击。因此，对于RSA进行病因学研究，以便有的放矢地制定统一、有效的诊疗方法显得尤为重要。膜联蛋白A5(annexinA5,AXNA5)是膜联蛋白(annexin，ANX)家族中少数具有抗凝活性的一员，其功能多样，研究[4]显示其与细胞凋亡、凝血过程、骨骼的生长发育以及部分肿瘤如宫颈癌和子宫内膜癌的发生相关。国外有不少相关文献[5-7]对膜联蛋白A5基因(ANXA5)单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)及相关单体型与RSA之间的关系进行了探讨。研究[8]显示ANXA5抗体在RSA患者中的水平下降。然而国内目前对于ANXA5的研究大多停留在分子水平，鲜有关于ANXA5基因多态性的研究。该研究试图从基因水平探讨AXNA5基因内含子2SNP与中国汉族人群URSA的关系，为认识和了解URSA提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料 选取2013年1月～2014年6月于安徽医科大学第一附属医院生殖中心就诊的213例URSA患者和170例有活产史、无流产史的对照者分别纳入病例组和对照组。对于URSA患者的诊断严格按照以下标准：① 同一对夫妇连续发生2次或者2次以上的自然流产；② 夫妻双方染色体核型均正常；③ 超声检查无子宫、生殖道解剖异常；④ 血清学检查已排除内分泌因素(糖尿病、甲状腺功能亢进、高泌乳素血症)、免疫因素(抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗淋巴细胞毒试验)、凝血异常(血栓性疾病或者血栓形成倾向)、感染(Torch病毒系列)等因素引起的复发性流产。对照者的入组标准为：有至少1次正常分娩史；无自然流产病史；夫妻双方染色体核型均正常。本实验严格遵守《赫尔辛基宣言》及其修正案的相关伦理条例，并顺利通过安徽医科大学伦理审查委员会的伦理审查。所有纳入本实验的患者在详细知情后签署知情同意书。

1.2 标本采集及储存 每位被纳入本研究的患者均由实验人员采集5ml的静脉血于5mlEDTA抗凝真空管中，并储存在-80 ℃超低温冰箱作为实验标本来源。

1.3 实验方法

1.3.1 提取基因组DNA使用QIAampDNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)，按照试剂盒内所提供的说明书从全血标本中提取基因组DNA。

1.3.2 设计引物 从UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)中下载人AXNA5基因内含子1区域5′端附近包含rs2306413在内的1 000bp的碱基序列，利用引物设计软件PrimerPremier5.0设计引物。并参照引物设计的基本原则，从软件生成的引物中挑选出最合适的一对(上游引物：5′-GATGATTTTGTCTCGCC-3′；下游引物：5′-ATGTGAGGCGAACGCA-3′)送至北京三博远志生物有限公司进行合成。

1.3.3 目的片段扩增 采用25μlPCR体系对目的片段进行扩增。PCR参数设置如下：95 ℃预变性3min，然后95 ℃变性30s，52.3 ℃退火30s，72 ℃延伸1min30s，循环35次，最后72 ℃延长8min。取2μlPCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶-溴化乙锭染色法电泳。

1.3.4 测序 通过紫外线凝胶成像分析仪观测记录PCR产物电泳结果，将显带清晰且位置正确的PCR产物送至北京六合华大基因公司测序。

1.4 统计学处理 采用STATA16.0软件进行分析，对对照组样本基因型分布频率进行Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinbergequilibrium,HWE)检验，若P>0.05，提示样本代表性好。对病例组和对照组样本rs2306413位点的等位基因频率和基因型频率进行χ2检验。

2 结果

2.1 临床资料分析 病例组URSA患者的平均年龄为(28.66±4.27)岁，平均流产次数(2.48±0.59)次。对照组平均年龄为(31.23±4.19)岁，平均流产次数0次。

2.2HWE检验 经STATA软件计算出对照组样本中的基因型分布HWE检验P=0.142。P>0.05，提示对照组rs2306413位点的基因型分布均符合人群正常遗传规律，样本代表性好。

2.3 等位基因频率和基因型频率的关联分析rs2306413的等位基因分布在病例组和对照组中差异有统计学意义(P=0.006)，且G等位基因为危险等位基因[比值比(oddsratio,OR)=1.526，95%置信区间(confidenceinterval, CI):1.127～2.066]。rs2306413的基因型在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P=0.005)。见表1。隐性模型下，rs2306413的基因型在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P=0.001)，含GG纯合基因型的妇女患URSA的风险显著升高(OR=3.039，95% CI：1.499～6.159)。而显性模型下，rs2306413的基因型在病例组和对照组中差异无统计学意义。见表2。

表1rs2306413等位基因和基因型在病例组和对照组中的分布(n)

rs2306413病例组(n=213)对照组(n=170)χ2值P值OR值(95%CI)等位基因 A2592397．4960．0061．526 G167101(1．127～2．066)基因型 AA838010．5840．005 AG9379- GG3711

表2 不同遗传模式下rs2306413基因型在病例组和对照组中的分布(n)

3 讨论

妊娠期间母体血容量增加，血液中凝血因子和纤溶酶原数量改变，凝血系统和抗凝系统达到新的平衡，使得血液呈高凝状态，称为妊娠期生理性高凝状态。而当血液中的凝血系统和抗凝系统失衡，则很容易导致血栓形成倾向。对于血栓形成倾向或者遗传性易栓症与RSA之间的关系已经有很多人都进行了探讨[9-12]。ANXA5作为膜联蛋白家族中数量最多、分布最广的一类，广泛存在于滋养细胞、单核细胞、巨噬细胞、毛细血管内皮细胞等多种组织中。其结构呈凹凸两面的圆盘状，凸面上有可以和钙离子以及磷脂结合的位点，其功能多种多样，与细胞凋亡、凝血过程、骨骼的生长发育、钙离子通道作用等多种生理过程以及部分肿瘤如宫颈癌和子宫内膜癌的发生相关[4]。本研究最关注的是ANXA5的抗凝作用。

不论是内源性凝血途径还是外源性凝血途径，凝血因子复合物的形成必须要依赖磷脂，尤其是磷脂中的磷脂酰丝氨酸的存在。妊娠时胎盘滋养细胞和血管内皮细胞大量表达ANXA5[13]，在钙离子存在的情况下，ANXA5与胎盘绒毛细胞膜表面的磷脂结合，在细胞膜表面排列成二维的晶体结构，形成一道保护屏障，使凝血因子接触不到磷脂，凝血因子复合物形成受阻，从而起到抗凝、维持正常妊娠的作用。一旦ANXA5在细胞膜表面形成的这种保护性屏障遭到破坏，或者由于抗磷脂抗体的拮抗使得细胞膜表面ANXA5数量减少，就有可能引起早期的流产[14-15]。 研究[16]显示，RSA患者的血浆ANXA5水平较对照组降低，也从侧面证实了这一理论。此外，ANXA5还可以与被激活的血小板表面的磷脂结合，通过抑制血小板的活性，而起到抗凝作用。

近年来不少国外学者都对ANXA5基因的SNP及其基因型和RSA之间的关系进行了探讨。Miyamuraetal[5]研究发现，ANXA5基因启动子区的rs1050606位点在RSA患者中的次要等位基因频率明显高于对照组(P=0.002)。Hayashietal[17]在一项病例对照研究中发现，rs1050606位点的等位基因频率在RSA患者和对照组中差异有统计学意义；且首次运用该多态性位点来评估RSA患者的妊娠结局。而国内目前对于ANXA5的研究多在分子水平，鲜有关于ANXA5基因多态性的研究。ANXA5基因位于染色体4q27，共包含13个外显子和12个内含子。由于外显子的突变可以直接改变基因的转录和翻译过程，影响氨基酸的合成和蛋白质的功能，因此一直以来对外显子的研究比较多，涉及内含子的功能研究相对较少。然而内含子序列占人类基因组的绝大部分，其也可通过影响mRNA剪切和增强基因表达等方式对疾病的发生发展产生重要的影响。因此，对内含子上基因遗传多态性的研究也具有重要意义。本实验通过对ANXA5基因内含子2上的多态性位点rs2306413和URSA之间的关系进行关联分析，结果显示rs2306413位点的等位基因和基因型分布在病例组和对照组中差异均有统计学意义，隐性遗传模式下，rs2306413位点GG纯合基因型增加URSA的患病风险。这些都提示ANXA5基因上的多态性位点rs2306413 和URSA相关，且G等位基因是URSA的危险基因。

综上所述，URSA是一个多因素影响的复杂性疾病。虽然本实验证实rs2306413位点和中国汉族人群的URSA发生相关，然而其对ANXA5基因转录和翻译过程的调控机制以及可能引起URSA的发病机制目前尚不清楚。今后应扩大样本量并加大研究深度，从SNP的功能验证和调控机制等方面继续研究该位点与URSA之间的关系，为完善URSA的病因研究和寻找治疗方法提供新思路。

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SNP in the intron 2 of ANXA 5 gene may be a risk factor for URSA in the Han Chinese population

LiuYunyun,XiangHuifen,CaoYunxia

(Reproductive Medicine Center, Dept of Obstetrics and Gynecology,The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Institute of Reproductive Genetics, Anhui Medical University,Anhui Provincial Engineering Technology Research Center for Biopreservation and Artificial Organs, Hefei 230022)

Objective To investigate the association between SNP rs2306413 and URSA in the Han Chinese population.Methods A total of 213 Han Chinese women with URSA and 170 fertile healthy controls were recruited in this case-control study. Allele frequency and genotype distribution of URSA patients and controls were determined. The Pearson chi-square test was used for analysis.Results rs2306413 showed a significant association with URSA cases compared with the controls(P=0.006). Genotype distribution of rs2306413 in the case group and the control group was statistically different(P=0.005) .The GG genotype increased the risk for URSA(OR=3.039, 95%CI:1.499～6.159).Conclusion rs2306413 may be a risk factor for URSA in the Han Chinese population.

URSA; ANXA5; SNP;association study

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.027.html

2016-07-06接收

国家自然科学基金面上项目(编号：81370691)；安徽医科大学国家创新研究群体科学基金获得者培育计划(编号：GJCXQT-1403)

安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖医学中心，安徽医科大学生殖与遗传研究所，安徽省生命资源保存与人工器官工程技术研究中心，合肥 230022

刘云云，女，硕士研究生；

曹云霞，女，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：caoyunxia6@126.com

对照组中的基因型分布差异有统计学意义(P=0.005)；携带GG纯合基因型的患者患URSA的风险增加(OR=3.039, 95%CI：1.499～6.159)。结论ANXA5的单核苷酸多态性rs2306413可能是中国汉族人群中URSA发生的一个危险因素。

R714.21

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.027