乳源免疫调节肽提高DDP对卵巢癌细胞的影响

周 娟，刘 琛，顾 芳，赵梦静，杨 雪，王 晶，秦宜德



乳源免疫调节肽提高DDP对卵巢癌细胞的影响

周 娟1，刘 琛1，顾 芳1，赵梦静1，杨 雪1，王 晶2，秦宜德1

目的 观察体外实验中乳源免疫调节肽(PGPIPN)与抗癌药物顺铂(DDP)联合用药对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响。方法MTS检测DDP联合PGPIPN对原代卵巢癌细胞增殖抑制情况，流式细胞术检测DDP联合PGPIPN对原代卵巢癌细胞凋亡率和周期的影响，细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果MTS实验表明PGPIPN联合DDP处理组对卵巢癌细胞抑制率显著高于单独用DDP组,差异有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量和时间依赖性。流式细胞术显示PGPIPN可以协同DDP促进人原代卵巢癌细胞的凋亡，并使得肿瘤细胞停滞于G0/G1期。细胞划痕实验显示联合用药明显抑制细胞的运动能力，与单独用药差异有统计学意义(P<0.05)。结论PGPIPN可以提高DDP对原代卵巢癌细胞的作用。

人原代卵巢癌细胞；联合用药；免疫调节肽；顺铂

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，其发病率位于女性生殖道恶性肿瘤的前列[1-2]。现有的治疗主要是手术和化疗两种方式，但化疗很容易出现耐药性，进而治疗效果逐渐降低，导致患者死亡率增高。如何增强卵巢癌对化疗药物的敏感性逐渐成为新的研究方向。乳源免疫调节肽(Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn，PGPIPN)来源于牛乳β-酪蛋白的 63～68氨基酸残基上的六肽，是一种典型的免疫调节肽。细胞实验研究[3-4]显示PGPIPN可以抑制卵巢癌细胞SKVO3的侵袭和转移，并促进其凋亡。动物实验[5-6]显示PGPIPN具有提高机体免疫力、促进淋巴细胞转化、抗氧化等作用。该研究基于前期研究的基础上，通过PGPIPN与DDP联合用药对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响来观察PGPIPN是否能改善卵巢癌对DDP的耐药性，为临床提高化疗敏感性提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 人卵巢癌组织 取自安徽医科大学第一附属医院妇产科手术室。

1.2 材料 纯度为99.6%的PGPIPN由上海生工公司合成；McCoy′s5AMedium培养基(美国Sigma公司)；小牛血清(杭州四季青公司)；顺铂(江苏诺欣药业公司)；CellTiter96AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(MTS) (普洛麦格北京生物技术有限公司)；PI单染周期检测试剂盒(江苏碧云天公司)；AnnexinV/PI双染凋亡试剂盒(上海贝博公司)。

1.3 方法

1.3.1 原代细胞培养 卵巢癌手术结束后尽快用预冷的含10%血清DMEM培养基运送至细胞房，用预冷无菌PBS缓慢冲洗癌组织块上的血细胞。无菌操作下将组织块用无菌眼科剪剪成1mm×1mm×1mm左右，无菌操作下转移至无菌50ml试管中，加入1.5%的胰蛋白酶，消化40～50min后，800r/min离心5min，弃上清液。将消化结束后的组织块用含20%胎牛血清的DMEM培养基吹打混匀后种于6孔板中放于37 ℃、5%CO2温箱培养。48h后将未贴壁的组织用PBS冲洗去除，贴壁的细胞继续培养至汇合率为70%～80%，传代后进行下一步实验。

1.3.2 免疫荧光法鉴定细胞 将灭菌后的盖玻片放在6孔板孔底部，将原代细胞种于6孔板中制成细胞爬片，放于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24h。弃去培养基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定细胞20min后，PBS洗3次，加入0.7%的Triton-100通透10min后，PBS洗3遍，10%羊血清封闭30min，PBS洗3遍后，加入一抗CK7(1 ∶200)，4 ℃过夜，PBS洗3遍，加入荧光二抗(1 ∶100) ，37 ℃避光孵育2h，避光下PBS洗3遍，避光下DAPI染10min，PBS洗3遍后将细胞爬片进行封片，立即在荧光显微镜下观察。

1.3.3MTS检测联合用药对人原代卵巢癌细胞增值的影响 原代细胞消化离心后制备成细胞悬液按照每孔1 500个细胞接种于96孔板中，培育过夜。分为5组加药：正常对照组、10μg/mlDDP、10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN、10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN、10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN，每组复孔5个，分别培养24、48、72h后，每孔加入20μlMTS放于37 ℃温箱继续孵育4h。用酶标仪检测各孔的490nm的吸光度(opticaldensity，OD)值(OD490nm)，以正常对照组计算用药组的生长抑制率。计算公式为：抑制率(%)=(1-OD实验组/OD正常对照组)×100%。

1.3.4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 原代细胞消化离心计数后每孔1×106接种于6孔板中，培养至细胞完全汇合后，用200μl的移液器枪头在6孔板每孔中央的纵轴和横轴方向划一个十字线。用PBS洗2遍后分为5组加药：正常对照组(3%血清培养基)、8μg/mlDDP、8μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN、8μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN、8μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN(药物均用3%血清培养基稀释)。在0、12、24、36h分别于倒置显微镜下观察并拍照。用QuantityOne软件对细胞的迁移距离进行测量，分别测3条线的宽度，取其平均值，计算迁移距离，其计算公式为：迁移距离(mm)=0h起始距离-各时间段的距离。

1.3.5AnnexinV/PI双染检测细胞的凋亡 原代细胞消化离心计数后每孔1×106接种于6孔板中培养过夜，分为5组加药，分组同1.3.3。培养48h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞后用预冷的PBS洗涤2次。每管加入300μlBindingBuffer和4μlAnnexinV-FITC悬浮细胞，4 ℃避光孵育15min后加入 7.5μlPI，5min后在流式细胞仪上进行检测，结果用FlowJo7.6.1软件进行分析。

1.3.6PI单染检测细胞的周期原代细胞消化 离心计数后每孔1×106接种于6孔板中培养过夜，分为5组加药，分组同1.3.3，用药48h后收集细胞。冷PBS洗涤2次后用70%酒精4 ℃固定过夜。固定结束后用冷PBS洗涤2次，每管加入16μlPI染色液、6μlRNaseA、300μl染色缓冲液，充分混匀后37 ℃避光孵育30min后在流式细胞仪上进行检测，结果用MFLT.32软件进行分析。

2 结果

2.1 细胞鉴定 组织消化法培养原代卵巢癌细胞48h，去除未贴壁的组织后，在倒置显微镜下的形态见图1A。将原代细胞制备成细胞爬片后，用特异性抗体CK7、有FITC的二抗鉴定细胞，细胞纯度通过以DAPI染色所得细胞核为准来计算。在荧光显微镜下可见：由于卵巢癌细胞表达CK7可见绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光,见图1。原代组织培养所得的细胞为卵巢癌细胞，且纯度较高(96.8%)。

图1 原代细胞鉴定 ×100

A：组织消化法培养原代卵巢癌细胞(箭头所指为组织块)；B：DAPI；C：FITC；D：B和C图叠加

2.2 联合用药对人原代卵巢癌细胞的增殖的影响 实验通过不同浓度的PGPIPN与相同浓度的DDP共同作用于人原代卵巢癌细胞，结果显示细胞的生长抑制率随着PGPIPN浓度的递增而逐渐增高(F=203.84)，且随着时间的延长而增高(F=4 848.20)。以不加药的正常对照组计算生长抑制率并绘制曲线图。联合用药组与DDP单独用药组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 MTS检测联合用药对人原代卵巢癌细胞的增殖影响

A：10μg/mlDDP；B：10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；C：10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；D：10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN；与10μg/mlDDP组比较：*P<0.05,**P<0.01

图3 不同浓度PGPIPN联合的DDP对人原代卵巢癌细胞迁移的影响 ×100

A：正常对照组；B：8μg/mlDDP；C：8μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；D：8μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；E：8μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN；1：0h；2：12h；3：24h；4：36h

图4 人原代卵巢癌细胞迁移距离与8 μg/ml DDP组比较：*P<0.05,**P<0.01

2.3 联合用药对细胞迁移的影响 不同浓度的PGPIPN与相同浓度的DDP共同作用于人原代卵巢癌细胞，结果显示细胞的迁移距离随着PGPIPN浓度的递增而逐渐减低(12h：F=13.35；24h：F=11.64；36h：F=15.30)。显微镜下结果见图3。以0h为起始距离计算迁移距离，与8μg/mlDDP组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。结果表明，PGPIPN可以促进DDP抑制人原代卵巢癌细胞迁移。

2.4 联合用药对细胞凋亡的影响 实验通过不同浓度的PGPIPN与相同浓度的DDP共同作用于人原代卵巢癌细胞，结果显示细胞的凋亡率随着PGPIPN浓度的递增而逐渐增高(F=111.20)，表明PGPIPN有协同DDP的作用，可以促进原代卵巢癌细胞的凋亡，见图5。

2.5 联合用药对细胞周期的影响 流式细胞术检测显示，与单独DDP组比较，联合用药组随着PGPIPN(10-6、10-4、10-2mg/ml)的浓度增加，S期逐渐下降，结果如下：9.21%、5.56%、0，而G1和G2期逐渐增高。实验结果表明PGPIPN与DDP联合使用主要是作用在G0/G1期。使得细胞停滞于G0/G1期，进而诱导细胞的凋亡并抑制增殖，见图6。

3 讨论

现有主要治疗卵巢癌的化疗药物有顺铂、紫杉醇等，但由于卵巢癌耐药性的出现，使得顺铂的治疗效果降低，卵巢癌的死亡率也逐年递增。因此临床上急需一种新药物来降低卵巢癌对顺铂的耐药性，减少药物用量，降低患者死亡率。

前期研究[6-7]表明，PGPIPN能显著促进腹腔巨噬细胞吞噬活性，刺激淋巴细胞转化等。实验[8]表明，PGPIPN也可通过下调Bcl2去诱导卵巢癌凋亡。研究[3]表明PGPIPN不能抑制小鼠永生化成纤维细胞MEFS以及正常人肝细胞LO2的生长。

图5 不同浓度的PGPIPN联合DDP对人原代卵巢癌细胞凋亡的影响

A：正常对照组；B：10μg/mlDDP；C：10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；D：10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；E：10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN；与10μg/mlDDP组比较：**P<0.01

图6 不同浓度PGPIPN联合DDP对人原代卵巢癌周期的影响

A：正常对照组；B：10μg/mlDDP；C：10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；D：10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；E：10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN

本研究显示不同浓度的PGPIPN与相同浓度的DDP共同作用于人原代卵巢癌细胞后，增殖抑制作用比单独用药强且呈时间剂量依赖关系。细胞迁移能力也显著低于单独用药组。细胞的凋亡率随着PGPIPN浓度的递增而逐渐增高，表明PGPIPN有协同DDP的作用，可以促进人原代卵巢癌细胞的凋亡。实验结果表明，PGPIPN可以增强顺铂对人原代卵巢癌细胞作用，增强卵巢癌对顺铂的敏感性。因此可以降低顺铂的用量，进而降低化疗药物的毒副作用。但具体相关机制还需进一步的研究，其机制可能与STATs有关。研究[9-11]已证实STAT3与卵巢癌、骨髓瘤、乳腺癌以及其它癌细胞的增殖、侵袭和转移能力有关。研究[12]显示STAT3通过影响CyclinD1的表达进而对细胞G1期进入S期产生影响。实验[13]显示，阻断STAT3通路能诱导耐药肿瘤细胞凋亡， 其机制主要是通过STAT3影响Caspase家族成员的表达。

由于PGPIPN的低毒副作用并且来源广泛，因此，其临床应用前景比较广阔，同时也为研发卵巢癌化疗辅助药物提供新的思路。

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ZhouJuan,LiuChen,GuFang,etal

(Dept of Biochemistry and Molecular Biology, Anhui Medical University,Hefei 230032)

Immunomodulating Peptide enhance the effect of DDP on ovarian cancer cells

Objective To observe the concomitant therapy effect of immunomodulating peptide(PGPIPN) and anti-cancer drug cisplatin(DDP) on the proliferation and migration of ovarian cancer cellsinvitro.Methods The inhibitory action of DDP with PGPIPN on the proliferation of primary ovarian cancer cells were detected by MTS. Apoptotic ratios and cell cycle of primary ovarian cancer cells were measured by flow cytometry. Cell scratch assays were carried out to test cells′migration.Results The result of MTS showed that the inhibition rate of the concomitant group against ovarian cancer cells was significantly higher than the group treated only with DDP. The difference was significant(P<0.05) and in a dose and time dependent manner. Flow cytometry results showed that PGPIPN could promote the apoptosis of human primary ovarian cancer cells by DDP, and the cycle of cells was arrested in G0/G1 phase.Cell scratch assays showed that concomitant therapy significantly inhibited cell movement, of which the difference from the group treated only with DDP of statistical significance(P<0.05).Conclusion PGPIPN can improve the effect of DDP on primary ovarian cancer cells.

human primary ovarian cancer cells; drug combination; PGPIPN; DDP

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.010.html

2016-05-19接收

国家自然科学基金(编号：81472448)

1安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，合肥 230032

2安徽医科大学第一附属医院妇产科，合肥 230022

周 娟，女，硕士研究生；

秦宜德，男，博士，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail:yideqin@ahmu.edu.cn

R73-351；R595.479.1；R979.1

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.010