大黄鱼鱼肉蛋白水解制备抗氧化肽的工艺

张 翀，李致瑜，田玉庭，郑宝东

(福建农林大学食品科学学院，福建福州350002)

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)属石首鱼科黄鱼属，又名黄花鱼、大王鱼和黄鱼等，是我国特色海水鱼养殖品种，为传统四大海产之一[1].大黄鱼含有丰富的蛋白质，营养价值高，目前以鲜食为主，研究多集中在养殖、保鲜和初级冷冻加工等方面[2－3]，而在精深加工方面仍比较薄弱，严重制约了大黄鱼产业的发展.因此，积极开展大黄鱼精深加工研究，推动产业转型升级势在必行.

研究发现，当人体内的抗氧化体系衰退或被破坏时，过量的自由基会造成细胞膜脂质过氧化，胞内蛋白质和核酸等功能丧失，导致氧化胁迫，引发一系列疾病，如癌症和糖尿病等[4].一些合成的抗氧化剂，如没食子酸丙酯和二叔丁基对甲酚等，由于其细胞毒性等副作用，其应用受到一定的限制[5].近年来，食源性抗氧化肽以其较高的吸收效率和安全指数，成为抗氧化剂研究的热点，其来源主要有畜禽蛋白(鸭肉[6]、鸡肉[7])、水产蛋白(鲫鱼[8]、贻贝[9])、植物蛋白(大米[10]、菜籽粕[11])等.其中，海洋蛋白资源丰富，是制备抗氧化肽的重要原料，研究者已从金枪鱼[12]、鲨鱼[13]、蓝圆鰺[14]等多种富含蛋白质的海洋生物中水解制备得到抗氧化肽.

本试验以闽东大黄鱼为原料，采用酶法水解制备抗氧化肽，以抗氧化能力和蛋白水解度为指标，确定最佳的水解用酶，并通过单因素试验和响应面法优化水解工艺，旨在为大黄鱼资源的开发与利用提供一定的理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 大黄鱼由福建福鼎海鸥水产食品有限公司提供，经去头、去皮和去内脏，切块后采用双层聚乙烯袋包装，置于－20℃冷冻备用.

1.1.2 试剂 碱性蛋白酶(20万U·g－1)、胰蛋白酶(250 U·mg－1)和中性蛋白酶(6万U·g－1)由北京索莱宝生物科技有限公司提供;木瓜蛋白酶(6万U·g－1)和复合蛋白酶(16万U·g－1)由诺维信(中国)生物技术有限公司提供;胃蛋白酶(1万U·mg－1)由Sigma公司提供;铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、邻苯三酚、氢氧化钠、浓盐酸、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠等均为分析纯.

1.1.3 仪器与设备 仪器与设备有PB-10 pH计[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]、绞肉机(永康市迪利工贸有限公司)、SHA-B恒温水浴振荡器(常州国华电器有限公司)、紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、DHG-9140(A)电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)、H1850R冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司).

1.2 水解工艺条件设计

1.2.1 水解工艺流程 流程:大 黄鱼肉→解 冻→破碎、绞 成肉糜→异 丙醇脱脂→挥发剩余异丙醇→加水匀浆 预热 酶 恒温解→灭酶→离心过滤→取上清液→大 黄鱼 水 解 液.

1.2.2 水解用酶的筛选 选择碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和复合蛋白酶，在各种酶最适的酶解条件下对大黄鱼鱼肉进行单酶水解.每隔一定时间取样，考察不同酶解时间下各种酶对大黄鱼鱼肉蛋白水解度和水解液还原力的影响，筛选出最佳的水解用酶，用以优化大黄鱼鱼肉蛋白水解工艺.蛋白酶种类及水解条件如表1所示.

表1 蛋白酶的水解条件Table 1 Hydrolysis conditions of P.crocea by different enzyme

1.2.3 单因素试验 以蛋白水解度及水解液的还原力和超氧阴离子自由基()清除力为主要考察指标，采用单因素试验设计，分别研究水解pH、酶添加量、水解温度、底物浓度和水解时间对中性蛋白酶水解大黄鱼效果的影响.

在酶添加量3000 U·g－1、底物浓度15%、水解温度45℃和水解时间5 h的条件下，研究不同pH(5.0－8.5)对大黄鱼水解效果的影响.

在底物浓度15%、pH 7.0、温度45℃和水解时间5 h的条件下，研究不同酶添加量(300－3600 U·g－1)对大黄鱼水解效果的影响.

在酶添加量2400 U·g－1、pH 7.0、水解时间5 h和底物浓度15%的条件下，研究不同温度(40－70℃)对大黄鱼水解效果的影响.

在酶添加量2400 U·g－1、pH 7.0、温度45℃和水解时间5 h的条件下，研究不同底物浓度(5%－30%)对大黄鱼水解效果的影响.

在酶添加量2400 U·g－1、pH 7.0、底物浓度 15%和水解温度 45 ℃的条件下，研究不同时间(0.5－10 h)对大黄鱼水解效果的影响.

1.2.4 水解工艺优化试验设计 在单因素试验的基础上，以水解时间、水解温度和底物浓度为自变量，以水解液的还原力为响应值，采用Box-Behnken试验设计，优化中性蛋白酶水解大黄鱼制备抗氧化肽的条件，试验因素水平如表2所示.

表2 响应面分析试验因素水平Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.3 指标测定

1.3.1 蛋白水解度的测定 蛋白水解度的测定参照厉望等[15]的方法，计算公式为:水解度/%=(A1－A0)/A×100.式中，A1为水解液中游离氨基态氮的含量，A0为水解前样液中氨基态氮的含量，A为原料蛋白液中总氮的含量.其中，游离氨基态氮含量按GB/T 5009.39－2003[16]中的甲醛滴定法测定.

1.3.3 水解液还原力的测定 还原力的测定参照Girgih et al[17]的方法并作修改.将2 mL样品溶液与2 mL 0.2 mol·L－1磷酸盐缓冲液(pH 6.6)混合，加入 2 mL 1%铁氰化钾，在 50 ℃下保温 20 min.加入 2 mL 10%三氯乙酸，混匀后在 3000 r·min－1离心 10 min.取 0.5 mL 上清液，加入 3.5 mL 蒸馏水和 0.4 mL 0.1%氯化铁在试管中反应10 min，于700 nm下测定D.D越高，说明样品的还原力越强.

1.4 数据处理

数据处理采用DPS软件，结果以平均值±标准差表示;响应面试验采用Design Expert 8.0.6软件绘图并进行方差分析.

2 结果与分析

2.1 水解用酶的筛选

不同蛋白酶对肽键的作用位点不同，选用不同的蛋白酶水解所得的抗氧化肽有较大差异[10].分别采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和复合蛋白酶水解大黄鱼鱼肉，水解效果如图1所示.水解时间为0.5－8 h时，各种酶的水解液都具有一定的抗氧化活性，其中以中性蛋白酶的水解效果最好，蛋白水解度和水解液的还原力最高，分别达到36.69%和0.860，其次为碱性蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，胃蛋白酶的水解效果最差.中性蛋白酶是来源于枯草芽孢杆菌的水解专一性较弱的内切酶，其切割末端，如苯丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸和甘氨酸残基等都具有较强的抗氧化能力.顾林等[8]采用中性蛋白酶水解鲫鱼鱼肉，其水解液表现出较强的DPPH·清除力、还原力和抑制油脂氧化能力.综上，选用中性蛋白酶进行大黄鱼水解工艺优化研究.

2.2 中性蛋白酶单因素试验结果

2.2.1 水解pH对水解效果的影响 溶液中的pH能改变蛋白酶活性位点的构象和酶与底物间的相互作用，从而影响水解效果[18].由图2可知，水解pH对大黄鱼鱼肉蛋白水解效果的影响显著(P＜0.05).pH为6.0－8.5时，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力随着pH的增加表现为先增大后减小的趋势;pH为7.0时，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力都达到最大，蛋白水解度及水解液的还原力和清除力分别为34.17%、0.859 和 82.41%.因此，确定最佳的水解 pH 为 7.0.

2.2.2 酶添加量对水解效果的影响 由图3可知，当底物浓度一定时，随着酶添加量的增加，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力逐渐增大.酶添加量为2400 U·g－1时，蛋白水解度及水解液的还原力和清除力达到最大，分别为 34.50%、0.874和 82.33%;之后蛋白水解度随着酶添加量的增加变化不大(P＞0.05).这可能是由于底物与酶的结合基本达到了饱和，或底物中酶的特定剪切位点被反应完全，导致蛋白水解度无显著增加[19].水解液的还原力和清除力与蛋白水解度的变化一致，这可能是在一定的蛋白水解度下，水解液具有合适且稳定的肽段长度和氨基酸比例，从而具有良好的抗氧化能力.综合考虑经济因素，确定适宜的酶添加量为2400 U·g－1.

图1 蛋白酶对蛋白水解度和水解液还原力的影响Fig.1 Effect of different enzyme on hydrolysis degree and reducing ability

图2 水解pH对蛋白水解度及水解液还原力和清除力的影响Fig.2 Effect of hydrolysis pH on hydrolysis degree，reducing ability and superoxide anion free radical scavenging ability

图3 酶添加量对蛋白水解度及水解液还原力和清除力的影响Fig.3 Effect of enzyme dose on hydrolysis degree，reducing ability and superoxide anion free radical scavenging ability

2.2.3 水解温度对水解效果的影响 温度对酶的催化反应影响较大，只有在一定温度范围内，酶才能保持较高的催化活性[19].一方面，升高温度可以增加底物的活化数值，增强其在溶液中的运动能力，从而提高与酶有效位点的结合概率;另一方面，过高温度可导致酶构象的转变，使酶的催化能力下降甚至丧失[20].此外，温度还可以影响酶促反应本身，包括酶和底物与水分子的相互作用、酶和底物分子解离基团的解离常数、酶与辅酶的结合[19]，从而影响蛋白质的水解.由图4可知:温度为40－70℃时，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力呈先增加后减小的趋势;温度为45℃时，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力达到最大，水解效果最佳;温度超过55℃时，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力迅速减小(P＜0.05)，二者呈较好的相关性，这可能是因为温度超过55℃时，酶构象迅速改变导致与底物的反应效率降低.因此，选择45℃为适宜的水解温度.

图4 水解温度对蛋白水解度及水解液还原力和清除力的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree，reducing ability and superoxide anion free radical scavenging ability

2.2.4 底物浓度对水解效果的影响 由图5可知:底物浓度为5%－20%时，随着底物浓度的增加，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力呈上升趋势(P＜0.05);底物浓度为20%时，蛋白水解度及水解液的还原力和O·－2清除力达到最大，分别为34.28%、0.892和84.57%;继续增加底物浓度，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力呈下降趋势，二者具有较好的相关性.这可能是由于当底物浓度超过20%时，酶切位点达到饱和，底物浓度的增加不再提高反应效率[19].另外，底物浓度过大降低了酶在溶液中的扩散能力，过量的底物可能通过分子间的作用力与酶形成稳定的中间产物，抑制了酶与底物的结合，导致蛋白水解度降低[21].此时，底物浓度的提高虽然可提高水解液中的多肽含量，但由于水解效率下降抑制了蛋白的深度水解，导致高活性抗氧化肽段比例下降;同时，高浓度的肽由于相互作用可能导致功能性位点被屏蔽，使抗氧化能力下降.综合考虑生产成本，确定适宜的底物浓度为20%.

图5 底物浓度对蛋白水解度及水解液还原力和清除力的影响Fig.5 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree，reducing ability and superoxide anion free radical scavenging ability

2.2.5 水解时间对水解效果的影响 由图6可知:水解时间为0.5－6 h时，水解液的抗氧化能力随着时间的延长逐渐增加;水解时间达6 h时，水解液的还原力和清除力分别为0.918和83.94%，此后，随着水解时间的延长，抗氧化能力无显著提高(P＞0.05).蛋白水解度随着水解时间的延长而增加，其与水解液的抗氧化能力相关性较差.这可能是因为进一步水解使肽类降解成低活性的氨基酸或生成促氧化多肽，抑制了Fe3+的还原或降低了水解液中多肽稳定自由基的能力[15].因此，选择适宜的水解时间为6 h.

图6 水解时间对蛋白水解度及水解液还原力和清除力的影响Fig.6 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree，reducing ability and superoxide anion free radical scavenging ability

2.3 水解工艺的响应面优化试验结果

2.3.1 方差与回归分析 根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，以水解液的还原力(Y)为响应值，以水解时间(A)、水解温度(B)和底物浓度(C)3个因素为自变量，采用3因素3水平的响应面分析方法.响应面优化试验设计方案与结果如表3所示.

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Experimental designs and results for response surface analysis

采用 Design Expert 8.0.6软件对表3的数据进行方差分析，结果(表4)表明:模型的P＜0.01，说明该回归模型显著，失拟项(P=0.336)不显著，说明方程拟合度高，可用此模型预测水解时间、水解温度和底物浓度对还原力的影响;模型中的二次项A2、B2和C2，一次项A和C以及交互项AC的影响极显著，一次项B和交互项AB的影响显著，可判断出各具体试验因子对响应值的影响呈非线性关系.

对表3的数据进行二次回归拟合和方差分析，剔除P＞0.05不显著项，得到还原力对以上3个因素的回归方程:Y=0.940+0.045A－0.018B+0.090C－0.028AB+0.061AC－0.089A2－0.034B2－0.110C2.式中，Y 为还原力的预测值，A、B和C分别为水解时间、水解温度和底物浓度的编码值.该方程反映了各因素与还原力之间的变化关系.此外，方程中的二次项系数均为负数，说明方程的抛物线函数开口向下，具有极大值点，可进行最大值优化分析.

表4 回归模型的方差分析1)Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

2.3.2 响应面分析 采用Design Expert 8.0.6软件对表3的数据进行模型分析，并绘制响应面曲线图，从响应面分析图上可直观地看出各因素之间的交互作用.

由图7可知，水解温度曲线比较平缓，相对于水解时间在试验范围内对水解液还原力的影响不明显.当水解时间小于5.5 h时，水解时间对还原力的影响显著;当水解时间超过6 h，等高线变得较为稀疏，水解时间对还原力的影响逐渐减弱.等高线呈斜向曲率较高的椭圆形，说明水解温度与时间之间有较好的交互作用.这可能是因为延长水解时间可弥补水解温度偏离导致的酶活性下降，使还原力维持在较高水平.

图7 水解时间和水解温度对水解液还原力影响的三维曲面图和等高线图Fig.7 Response surface plot and contour plot of influence of hydrolysis time and hydrolysis temperature on reducing ability

由图8可知，水解时间与底物浓度的交互作用明显.当水解时间和底物浓度较低时，水解液还原力随着两者的增加而显著上升;当水解时间大于6 h，底物浓度大于20%时，还原力基本稳定在较大值.这可能是由于当底物浓度处在较高水平时，水解时间的延长可避免底物水解不足.

由图9可知，当底物浓度大于20%时，水解温度对水解液还原力的影响不显著，极大值位置几乎处于同一水平面，说明两者间的交互作用并不明显，水解温度对酶活性的影响不足以显著改变高浓度底物水解液的还原力.结合交互项的显著性分析，表明水解温度和底物浓度对还原力的交互作用不显著.

图8 水解时间和底物浓度对水解液还原力影响的三维曲面图和等高线图Fig.8 Response surface plot and contour plot of influence of hydrolysis time and substrate concentration on reducing ability

图9 水解温度和底物浓度对水解液还原力影响的三维曲面图和等高线图Fig.9 Response surface plot and contour plot of influence of hydrolysis temperature and substrate concentration on reducing ability

利用Design Expert 8.0.6软件对上述回归方程求解，得到中性蛋白酶水解大黄鱼鱼肉的最优条件组合为:底物浓度 26.55%、水解温度 46.38 ℃、水解时间 7.2 h、pH 7.0、酶添加量 2400 U·g－1，此时水解液的还原力为0.967.考虑到实际操作，将优化后的参数调整为:底物浓度26.55%、水解温度46℃、水解时间7.2 h、pH 7.0、酶添加量2400 U·g－1.采用调整后的工艺条件进行验证试验，重复3次得到的还原力为0.963，实测值和理论预测值误差小于1%，说明采用响应面法优化得到的酶解条件可靠.该条件下测得的清除力为87.46%，蛋白水解度为36.51%.

3 结论

(1)通过比较碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和复合蛋白酶对大黄鱼鱼肉蛋白的水解效果，筛选出中性蛋白酶为制备大黄鱼抗氧化肽的首选蛋白酶.

(2)采用单因素试验和响应面分析对中性蛋白酶的水解条件进行优化的结果表明，水解过程中鱼肉蛋白的水解度与其抗氧化能力之间有较好的相关性.中性蛋白酶水解的最优工艺条件为:底物浓度26.55%、水解温度 46 ℃、水解时间 7.2 h、pH 7.0、酶添加量 2400 U·g－1，在此条件下的蛋白水解度为36.51%，水解液的还原力为 0.967清除力为 87.46%.

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