燕窝主要营养成分及其唾液酸酶法提取工艺

陈 玲，陈昕露，范群艳，张 怡，钟小花，郑宝东

(1.厦门市丝浓食品有限公司，福建 厦门361101;2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州350002)

燕窝是雨燕科几种金丝燕分泌的唾液及其绒羽混合粘结所筑成的巢穴[1－2]，主产于马来西亚、印度尼西亚、泰国和缅甸等东南亚国家及我国的福建和广东沿海地带.燕窝含有丰富的糖类、有机酸、游离氨基酸以及特征物质——唾液酸，具有滋阴、润燥和补中益气等功效，作为药食两用的高档滋补品，深受国内外消费者的喜爱[3－6].

唾液酸是一类九碳单糖骨架衍生物的总称，大约有50余种.唾液酸具有多种生物调节功能，如抗老年痴呆、抗病毒、抗炎症和抑制白细胞的粘附等[7].因此，近年来唾液酸成为了鉴别燕窝优劣的主要指标，并且也是开发燕窝功能性新产品的重要功能成分.燕窝中的唾液酸多以结合的形式与粘多糖、糖蛋白和糖脂中的低聚糖链相连接，正因为如此，在燕窝炖煮的过程中有部分唾液酸无法完全释放.目前，酶制剂越来越多地用于食品加工中，木瓜蛋白酶作为一种天然酶制剂，具有较强的水解能力及活性，能水解食物中的蛋白类成分[8－9].

本试验对燕窝的主要营养成分进行研究，测定游离氨基酸、水分、脂肪、蛋白质和唾液酸的含量，为燕窝质量评判标准的建立提供一定的科学依据;同时研究木瓜蛋白酶在燕窝唾液酸提取中的应用，确定最佳的酶解工艺，旨在为燕窝中唾液酸的综合利用提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料

燕窝原产于马来西亚，由厦门市丝浓食品有限公司提供.

唾液酸标准品、牛血清白蛋白由Sigma公司出品;木瓜蛋白酶(酶活力为2.5×106U·g－1)由北京化学试剂公司出品;盐酸、氢氧化钠、冰醋酸、茚三酮、石油醚、考马斯亮蓝G-250等试剂均为分析纯(AR).

主要仪器设备有PL602-L电子天平(梅特勒—托利多仪器上海有限公司)、DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)、L530离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、UV-2000型紫外可见分光光度计(尤尼科上海仪器有限公司)、THZ-82型水浴恒温震荡器(常州国华电器有限公司)、HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、L8900氨基酸分析仪(日本Hitachi公司).

1.2 燕窝中氨基酸、水分和脂肪含量的测定

燕窝中的氨基酸含量使用氨基酸分析仪，按照GB/T 5009.124－2003[10]的方法测定;水分含量按照GB 5009.3－2010[11]中的直接干燥法测定;脂肪含量按照 GB/T 5009.6－2003[12]中的索氏提取法测定.

1.3 燕窝中蛋白质含量的测定

1.3.1 标准曲线的绘制 蛋白质标准样品的制备如表1所示;以蛋白质含量为横坐标，光密度(D)为纵坐标绘制标准曲线(图1).

表1 蛋白质标准样品的制备Table 1 Preparation of protein standard sample

图1 蛋白质的标准曲线Fig.1 Protein standard curve

1.3.2 样品蛋白质含量的测定 准确称取200 mg燕窝放入研钵中，加入5 mL蒸馏水研磨成匀浆，于4000 r·min－1离心10 min.将上清液倒入10 mL容量瓶中，再向残渣中加入2 mL蒸馏水，悬浮后再离心10 min，合并上清液，定容至刻度.另取1支具塞试管，准确加入0.1 mL样品提取液，再加入0.9 mL蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝G-250，充分混合，放置2 min后，以标准曲线1号试管作参比，在595 nm波长处比色，记录D.通过标准曲线计算样品中的蛋白质含量.蛋白质含量/%=[查得的蛋白质含量/(μg·mL－1)×提取液总体积/mL]/[样品鲜重/g×测定时取用提取液的体积/mL].

1.4 燕窝中唾液酸含量的测定

1.4.1 标准曲线的绘制 分别配制 0、5、10、20、50、100 和 200 μg·mL－1标准唾液酸溶液，吸取 1 mL，加入1 mL冰醋酸和1 mL酸性茚三酮，水浴10 min，待其迅速冷却后在470 nm波长处测定D.以唾液酸含量为横坐标，D为纵坐标绘制标准曲线(图2).

1.4.2 固体燕窝中唾液酸含量的测定 燕窝研磨过筛后，称取0.12 g放入锥形瓶中，加入10 mL 50%醋酸，在电热炉上加热水解，待水解完毕迅速转移到容量瓶中，加水至50 mL，定容.取出10 mL待测的水解液或酶解液至离心管中，加入1.25 g硫酸铵蛋白沉淀剂，搅拌至沉淀剂溶解，在3000 r·min－1高速离心机中离心10 min.取上清液1 mL与1 mL酸性茚三酮和1 mL冰醋酸混合摇匀，在沸水浴中保温10 min，待其冷却后在470 nm波长处测定D[13]，通过标准曲线计算样品中的唾液酸含量.唾液酸含量/%=(c×50×10－6)/(m×0.1347)×100.式中，c:从标准曲线上查到的唾液酸含量/(μg·mL－1);50:提取后定容体积/mL;m:样品的质量/g;0.1347:1 g标准燕窝中唾液酸的含量/(μg·mL－1).

1.5 酶法提取燕窝唾液酸的试验设计

1.5.1 步骤 称取燕窝→磨细过40 目筛→加入一定料液比的水→一定量的木瓜蛋白酶酶解(相对于干燕窝重量 )→酶解液于100℃ 灭 活→隔沸水炖煮30 min→测定唾液酸的提取率.

1.5.2 单因素试验 单因素试验设计如表2所示，分别研究料液比、酶添加量、酶解时间、酶解温度和pH对燕窝唾液酸提取率的影响.

图2 唾液酸标准曲线Fig.2 Sialic acid standard curve

表2 单因素试验设计水平表Table 2 Levels of single-factor experimentation design

1.5.3 正交试验 在单因素试验的基础上，选取液料比(A)、pH(B)、酶解时间(C)和酶解温度(D)对燕窝唾液酸提取率进行L9(34)正交设计(表3)，分析各因素对唾液酸提取率的综合影响，确定木瓜蛋白酶提取唾液酸的最佳工艺条件.固定条件为:酶添加量4%.

表3 正交试验因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 燕窝的主要营养成分

2.1.1 氨基酸的种类和含量 从表4可以看出:燕窝中的氨基酸种类丰富，富含苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸和精氨酸等.燕窝中的水解氨基酸含量达42.272%，且必需氨基酸含量占氨基酸总量的42%;同时，呈鲜味特征的氨基酸(天门冬氨酸和谷氨酸)和呈芳香味特征的氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)含量较高，表明燕窝的味道鲜美.

食物营养价值的优劣主要取决于所含氨基酸的种类、数量和比例.联合国粮农组织和世界卫生组织提出了食品中必需氨基酸参考模式谱，规定了人体必需氨基酸占总氨基酸的质量比以及必需氨基酸与非必需氨基酸的质量比分别为40%和60%[14].

2.1.2 主要营养成分 燕窝中的蛋白质含量较高，但与其品种关系紧密[15].本试验选用的马来西亚金丝燕燕窝，其蛋白质含量达50.26%.唾液酸又称燕窝酸，是燕窝主要的生物活性成分，在燕窝中主要以N-乙酰神经氨酸形式存在.据报道，一般燕窝的唾液酸含量可达7%以上[16]，这也是初步鉴定真假燕窝的手段.本试验测得样品唾液酸含量为13.47%，脂肪含量为0.18%.

表4 燕窝中的氨基酸含量Table 4 Amino acid content of edible bird's nest %

2.2 单因素对燕窝唾液酸提取率的影响

2.2.1 液料比的影响 从图3可以看出，燕窝唾液酸的提取率随着液料比的增大而升高，在料液比为30∶1时达到最大值，此后提取率趋于平缓.因此，确定最佳的液料比为30∶1.

2.2.2 酶添加量的影响 随着木瓜蛋白酶添加量的增加，燕窝唾液酸中的糖蛋白不断被分解，导致唾液酸的含量显著增大.由图4可知，酶添加量超过4%时，唾液酸提取率趋于平缓.由于木瓜蛋白酶具有特殊气味，添加量若再增加会给燕窝带来异味;但若减少木瓜蛋白酶的添加量，则唾液酸的提取率下降.因此选取的酶添加量为4%，并在此条件下进行正交试验.

2.2.3 酶解时间的影响 由图5可知:酶解开始时随着酶解时间的延长，底物酶解越充分，故燕窝唾液酸提取率也越高;当酶解时间超过2 h，唾液酸已充分酶解溶出，随着酶解时间继续延长，唾液酸提取率不再变化.

图3 液料比对唾液酸提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of edible birds'nest sialic acid

图4 酶添加量对唾液酸提取率的影响Fig.4 Effect of enzyme concentration on extraction rate of edible birds'nest sialic acid

图5 酶解时间对唾液酸提取率的影响Fig.5 Effect of time on extraction rate of edible birds'nest sialic acid

2.2.4 酶解温度的影响 在蛋白质酶解反应中温度是重要的参数之一，温度影响了蛋白酶催化反应速率及其稳定性.由图6可知，酶解温度对燕窝唾液酸的提取率影响显著.温度为30－50℃时，唾液酸的提取率随着温度的升高而迅速提高，在50℃时达到最大值;温度为50－70℃时，唾液酸的提取率随着温度的升高而下降.温度超过50℃后唾液酸的提取率骤降，这主要是由于反应温度过高，木瓜蛋白酶活性的降低影响了酶解过程，从而影响唾液酸的溶出.因此酶解温度应控制在45－55℃.

2.2.5 pH的影响 由图7可知，燕窝唾液酸的提取率随着pH的升高而提高，当pH为7时达到最大值，此后随着pH的升高而下降.这主要是因为木瓜蛋白酶最适的pH为6－7，等电点约为8.75，当pH为9时，酶活力被抑制，唾液酸的提取率也下降.

图6 酶解温度对唾液酸提取率的影响Fig.6 Effect of temperature on extraction rate of edible birds'nest sialic acid

图7 pH对唾液酸提取率的影响Fig.7 Effect of pH on extraction rate of edible birds'nest sialic acid

2.2.6 正交试验结果 选取液料比(A)、pH(B)、酶解时间(C)和酶解温度(D)进行L9(34)正交设计，结果如表5所示.

表5 L9(34)正交试验结果Table 5 Orthogonal experimental results

由表5可知，影响木瓜蛋白酶酶解提取燕窝唾液酸因素的主次顺序为:C＞A＞D＞B，最优方案为C3A3D1B2，即酶解时间2.5 h、液料比30∶1、酶解温度45℃、pH 8.由于最优组合C3A3D1B2未出现在试验方案中，应进行验证试验.结果表明，在酶解温度45℃、液料比40∶1、pH 8的条件下酶解2.5 h，唾液酸的提取率为(9.98±0.05)%，传统水提法处理的唾液酸提取率为(9.08±0.12)%，酶法比传统水提法的提取率高 9.91%.

3 结论

唾液酸及其衍生物在各种生命活动的调节及细胞间相互识别中起作用，在抗流感病毒、促进神经细胞生长和抗老年痴呆等方面有很重要的应用价值[17－18].在单因素试验的基础上进行正交试验，得到酶法提取唾液酸的最优工艺条件为:酶解温度45℃、液料比40∶1、酶添加量4%、pH 8，在此条件下酶解2.5 h，唾液酸的提取率为(9.98±0.05)%，比传统水提法的提取率提高了9.91%.说明此法可有效提高燕窝唾液酸的提取率，同时避免因高温造成唾液酸的破坏和损失，保护燕窝中的特征营养成分.

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