发酵时间和料水比对豆粕发酵的影响

詹湉湉，柯芙容，陈庆达，张少华，许丽惠，王全溪，王长康

(1.福建农林大学动物科学学院，福建 福州350002;2.晋江市绿色保健蛋品有限公司，福建 晋江362200)

随着畜禽养殖规模的快速发展，对豆粕的需求越来越大.但豆粕中含有胰蛋白酶抑制剂、植物血球凝集素、脲酶、大豆抗原蛋白、低聚糖和植酸等抗营养因子，大大降低了豆粕的利用率[1].如何提高豆粕的利用率是急需解决的重大问题.去除豆粕中抗营养因子的方法主要有物理、化学和生物学方法.物理法主要采用高温膨化，效果好，但能源消耗大、成本高;化学法主要采用适当的化学试剂处理豆粕，虽有一定效果，但易使化学物质残留，污染环境，且工艺较复杂，而且营养成分易被破坏，导致豆粕营养价值降低;生物学方法主要采用生物育种和生物学技术对豆粕进行处理，目前在国内外研究较多[2－3].

采用微生物发酵豆粕，已被证明是一种有效降低和去除抗营养因子的方法[4－5].发酵豆粕是利用现代生物工程技术生产的低抗营养因子[6]的优质蛋白质饲料，将大分子蛋白质酶解成多肽、小肽及游离氨基酸[7]，同时含有大量的益生菌、乳酸菌及未知生长因子等物质[8].影响豆粕发酵的因素很多，而国内外关于豆粕发酵适宜菌种的选择及发酵工艺参数的研究才刚起步[9－10]，且目前研究报道多为单一菌种或混合菌种对发酵豆粕抗营养因子的影响，在发酵豆粕营养特性上的研究不多.为了进一步研究混合菌种发酵对豆粕品质的影响，本试验采用凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌混合菌种发酵豆粕，研究发酵时间和料水比对发酵豆粕营养成分的影响，确定豆粕适宜的发酵参数，旨在为微生物发酵豆粕的研究与应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

发酵剂由福建厦门洛东生物环保科技有限公司提供，含有凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌，总活菌数为1×109cfu·g－1.其中，凝结芽孢杆菌活菌数为2×108cfu·g－1，枯草芽孢杆菌活菌数为5×108cfu·g－1，酵母菌活菌数为3 ×108cfu·g－1.

豆粕购于厦门中禾实业有限公司，粗蛋白质含量为43.13%，水分含量为12.17%.

发酵豆粕基础配方组成:100 kg豆粕+1 kg玉米+水+20 g菌种.

1.2 发酵工艺优化

试验采用单因素处理，由发酵时间优化和发酵水分优化两部分组成，两个发酵过程均需要密封，发酵袋保持一定的高度，室温为35℃左右.

1.2.1 发酵时间优化 试验设两个水平，每个水平3个重复，在基础发酵培养基上，室温厌氧分别发酵48和72 h.

1.2.2 发酵水分优化 试验设3个水平，每个水平3个重复，在基础发酵培养基上，加水量分别为40、55和 70 kg，即料水比分别为 1∶0.40、1∶0.55 和 1∶0.70，室温下厌氧发酵 72 h.发酵 72 h 后，测得发酵豆粕中的含水量分别为 37.85% 、44.27% 和 49.19%.

1.3 指标测定

1.3.1 常规营养成分的测定 水分和粗蛋白质含量按常规方法[11]测定;游离氨基酸含量采用甲醛滴定法[12]测定;酸溶性蛋白质含量采用三氯乙酸(TCA)法[13]测定;单宁酸溶性蛋白质含量采用单宁沉淀法[12]测定.

多肽和寡肽含量通过计算得出.多肽含量=酸溶性蛋白质含量－游离氨基酸含量;寡肽含量=单宁酸溶性蛋白质含量－游离氨基酸含量.

1.3.2 pH测定 pH采用玻璃电极pHS-3C型pH计测定.

pH测定的具体步骤:准确称取1 g样品和9 g蒸馏水(采用移液枪准确移取9 mL蒸馏水)，振荡、摇匀后用pH计测定.

1.3.3 活菌含量的测定 活菌总数采用稀释平板计数法[14]测定.

1.4 数据处理

原始数据经Excel 2003软件处理后，采用SPSS 16.0软件进行分析.其中，发酵时间优化的数据采用成组样本T检验，发酵水分优化的数据采用单因素方差分析.差异显著后进行LSD多重比较，结果用平均值±标准差表示.

2 结果与分析

2.1 发酵时间对发酵豆粕品质的影响

2.1.1 对常规营养成分的影响 从发酵时间对发酵豆粕常规营养成分的影响(表1)可以看出，发酵72 h组与发酵48 h组相比，其游离氨基酸+寡肽和(游离氨基酸+寡肽)/粗蛋白质极显著提高(P＜0.01)，其他指标均有提高，但差异不显著(P＞0.05).可见，发酵72 h的效果比发酵48 h的效果好.

2.1.2 对pH和活菌数的影响 从发酵时间对发酵豆粕pH和活菌数的影响(表2)可以看出，发酵72 h组与发酵48 h组相比，其pH极显著降低(P＜0.01)，而活菌数未出现明显变化(P＞0.05).可见，发酵72 h的效果比发酵48 h的效果好.

表1 发酵时间对发酵豆粕常规营养成分(绝干物质基础)的影响1)Table 1 Effects of fermentation time on nutritional composition of soybean meal(dry matter basis) %

2.2 料水比对发酵豆粕品质的影响

2.2.1 对常规营养成分的影响 从料水比对发酵豆粕常规营养成分的影响(表3)可以看出，与料水比为1∶0.40 组相比，料水比为1∶0.55 组的游离氨基酸、寡肽、游离氨基酸+寡肽和(游离氨基酸+寡肽)/粗蛋白质极显著提高(P＜0.01)，寡肽/粗蛋白质显著提高(P ＜0.05).与料水比为 1∶0.40 和1∶0.55组相比，料水比为 1∶0.70 组的游离氨基酸/粗蛋白质、寡肽、寡肽/粗蛋白质和(游离氨基酸+寡肽)/粗蛋白质极显著提高(P＜0.01);游离氨基酸显著高于料水比为 1∶0.40 组(P ＜0.05)，与料水比为 1∶0.55 组的差异不显著(P ＞0.05);多肽和多肽/粗蛋白质极显著高于料水比为1∶0.40 组(P ＜0.01)，与料水比为 1∶0.55 组的差异不显著(P ＞0.05);游离氨基酸 +寡肽极显著高于料水比为1∶0.40 组(P ＜0.01)，显著高于料水比为1∶0.55 组(P ＜0.05).

表2 发酵时间对发酵豆粕pH和活菌数的影响1)Table 2 Effects of fermentation time of soybean meal on pH and viable counts

表3 料水比对发酵豆粕常规营养成分(绝干物质基础)的影响1)Table 3 Effects of material-water ratio on the nutritional composition of soybean meal(dry matter basis) %

2.2.2 对pH和活菌数的影响 从料水比对发酵豆粕pH和活菌数的影响(表4)可以看出:与料水比为 1∶0.40 组相比，料水比为 1∶0.70 和 1∶0.55 组的pH极显著降低(P＜0.01)，活菌数显著提高(P＜0.01);与料水比为 1∶0.55 组相比，料水比为 1∶0.70组的pH极显著降低(P＜0.01).可见，料水比为1∶0.70的发酵效果最优.

表4 料水比对发酵豆粕pH和活菌数的影响1)Table 4 Effects of material-water ratio of soybean meal on pH and viable counts

3 讨论

3.1 发酵时间对发酵豆粕品质的影响

发酵终点对提高产物的生产率有非常重要的意义.在发酵过程中，产物的浓度是变化的，一般产物高峰生长阶段时间越长，生产率就越高，但到一定时间后生产率提高缓慢，甚至下降.因此无论是获得菌体还是代谢产物，微生物发酵都有一个最佳时间.时间过短，不足以获得所需的产量以及优质发酵产品;时间过长，由于环境已不利于菌体生长，往往造成菌体自溶，产量下降，同时增加生产成本.本试验结果显示，发酵72 h组的游离氨基酸+寡肽和(游离氨基酸+寡肽)/粗蛋白质极显著高于发酵48 h组，pH极显著低于发酵48 h组.表明凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌混合菌种发酵豆粕的最佳时间为72 h，与李文立等[15]和莫重文等[16]的研究结果一致.同样，朱曦等[9]研究表明，发酵时间为72 h时，豆粕中的抗营养因子能有效地被去除;朱平军等[17]研究也表明，最佳发酵时间为72 h，黑曲霉发酵豆粕中的酸溶蛋白质含量由发酵前的1.75%提高到13.62%.以上研究结果均表明发酵72 h的效果好，这可能是因为随着发酵时间的延长，豆粕发酵更加彻底.本试验结果与邢力等[18]和胡瑞等[19]的“48 h为最适发酵时间”研究结果不同.由于影响豆粕发酵的因素很多，而且评定指标也不尽相同，因此研究结果也存在一定的差异，尤其是在菌种选择、发酵的工艺参数以及对豆粕营养价值影响的研究结果差异较大.可见，发酵时间一定要根据不同的菌种、工艺条件和产物，通过试验来确定.

3.2 料水比对发酵豆粕品质的影响

固态发酵基质的含水量是决定固态发酵成功与否的关键因素之一.基质含水量高，容易导致基质多孔性降低，减少基质内气体，但能增加营养成分和菌体的流动性;而含水量低，造成基质膨胀程度低，菌体生长受抑制，酶产量下降.基质含水量不仅影响微生物的生长，还影响发酵系统中氧气的供应、气体交换等活动，关系到发酵的成败.本试验综合各项指标可得，采用凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌混合菌种发酵豆粕的最佳料水比为1∶0.70.这一研究结果与王德培等[20]的研究结果类似，与王平[21]和高爱琴等[22]的“最佳发酵料水比为1∶0.6和3∶2”研究结果也相近.本试验结果表明:料水比为1∶0.70组的游离氨基酸和活菌数显著高于料水比为1∶0.40组;游离氨基酸/粗蛋白质、寡肽、寡肽/粗蛋白质和(游离氨基酸+寡肽)/粗蛋白质极显著高于料水比为 1∶0.40 和1∶0.55 组;pH 极显著低于料水比为 1∶0.40 和 1∶0.55 组;多肽、多肽/粗蛋白质和游离氨基酸+寡肽极显著高于料水比为1∶0.40组，高于料水比为1∶0.55组(差异不显著).朱曦等[9]研究表明:料水比为1∶(0.8－1.0)时，豆粕中的抗营养因子能有效被去除;此外，胡瑞等[19]研究表明:发酵后，料水比为1∶0.6组除挥发性盐基氮含量外，其他指标均优于料水比为1∶0.40组，但挥发性盐基氮含量偏高，因此选择1∶0.40为最适发酵料水比.陈炳钿等[23]研究表明，最佳发酵工艺条件为:地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的配比为(2∶1∶1)×109，接种量为10%，含水量为45%，采用好氧48 h、厌氧24 h的固态发酵工艺.以上研究结果存在差异的原因可能与菌种、发酵工艺以及测定指标等不同所致.因此，适合的料水比一定要根据不同菌种和发酵条件等，通过试验来确定.

3.3 微生物发酵可以显著提高豆粕的品质

3.3.1 微生物发酵对豆粕常规营养成分的影响 本试验中，豆粕经微生物发酵后，豆粕中粗蛋白质的总量无显著变化，但蛋白质组成发生了改变，大、中分子蛋白质水平降低了，小肽和游离氨基酸的水平提高了，改善了豆粕的营养价值，这一结果与陈中平等[24]的研究结果一致，而且发酵豆粕的pH和活菌数也有显著性变化.豆粕在发酵过程中，原料豆粕中的真蛋白质在枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和酵母菌分泌的众多酶系作用下，由大分子蛋白质分解为小分子蛋白质，有序地降解为多肽以及大量具有特殊生理活性的小肽和游离氨基酸等，这就使得发酵豆粕中的小肽和游离氨基酸含量增加.

研究表明，微生物发酵可以把蛋白质水解为氨基酸、多肽和小肽等小分子物质，提高蛋白质的利用率[25].Hong et al[5]研究表明，豆粕发酵后，豆粕中的大分子蛋白质降解为小分子肽;马文强等[3]研究表明，发酵后豆粕中的大分子蛋白质含量较发酵前降低了75.57%，中分子蛋白质含量较发酵前降低了86.7%，小分子蛋白质含量较发酵前提高了2.25倍.虽然前人的研究存在差异，但发酵均不同程度地改善了豆粕品质.本试验结果表明，豆粕在发酵过程中，枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和酵母菌分泌的众多酶系也有效地将豆粕中的大分子蛋白质降解为小分子蛋白质.

3.3.2 微生物发酵对pH和活菌数的影响 豆粕经发酵后，具有浓郁的酸香味，提高豆粕的适口性.许多研究表明，pH为4.5－5.5，会明显提高饲料的诱食性.

豆粕发酵后除会提高常规营养成分外，还含有有益微生物及其代谢产物.由于在豆粕发酵过程中加入了有益微生物，因此发酵后的物料中含有大量有益微生物种群，其种类主要取决于发酵前物料中所添加的微生物，常见的有芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌，这些益生性微生物对于环境和畜禽的健康均具有非常重要的作用.陈文静[26]对发酵后的豆粕进行测定，发现乳酸菌数达到107cfu·g－1;康立新[27]研究发现，发酵过程中微生物代谢产生的有效活菌数达到4.20×108cfu·g－1.本试验对发酵后的豆粕进行测定，其活菌含量也有极显著提高，活菌数达到2.54×109cfu·g－1.

4 结论

本试验结果显示:发酵72 h组的游离氨基酸+寡肽和(游离氨基酸+寡肽)/粗蛋白质极显著高于发酵48 h组，pH极显著低于发酵48 h组;料水比为1∶0.70组的游离氨基酸和活菌数显著高于料水比为1∶0.40组，游离氨基酸/粗蛋白质、寡肽、寡肽/粗蛋白质和(游离氨基酸+寡肽)/粗蛋白质极显著高于料水比为1∶0.40 和 1∶0.55 组，pH 极显著低于料水比为1∶0.40 和1∶0.55 组，多肽、多肽/粗蛋白质和游离氨基酸+寡肽极显著高于料水比为1∶0.40组.本试验得出的凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌混合菌种发酵豆粕的最佳工艺条件为:凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌的配比为(2∶5∶3)×108，料水比为1∶0.70(即含水量为 49.19%)，接种量为 0.02%，厌氧发酵 72 h.

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