比较time-lapse培养和常规体外受精胚胎培养对临床结果的影响

张欢，郑屹，王海青，周颖，周玮，吴永根，黄学锋

（温州医科大学附属第一医院生殖中心，温州 325000）

在辅助生殖中，移植胚胎的发育潜能是影响临床结果的重要因素［1］。因此，在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）过程中合理选择高发育潜能的胚胎至关重要。目前胚胎评价主要基于胚胎的发育速度，以及胚胎的形态学。虽然各个辅助生殖中心的胚胎形态学评价标准有所差异，但评价卵裂期胚胎的指标主要还是碎片程度、卵裂球的数目、均一度、形态、对称性等指标［2-4］。而囊胚期则主要评估囊腔大小、内细胞和滋养层细胞的多少［5］。这些指标能大致反映胚胎体外发育是否正常以及植入后发育潜能的大小。然而，一些研究［6-7］发现胚胎形态学评分结合特定时间点胚胎发生事件可以提高胚胎的种植率。因此，一些学者认为尽可能多了解胚胎发育信息有助于遴选高发育潜能的胚胎。近年兴起的延时摄像胚胎观测技术（time-lapse）能自动获取胚胎发育各个阶段的形态以及各事件发生的特定时间，并能够保证观察过程中胚胎发育环境的稳定，提供更多信息进行胚胎挑选移植。本研究旨在分析比较timelapse培养和常规IVF 胚胎培养对临床结果的影响，探讨time-lapse培养是否更有利于培育高潜能胚胎。

对象和方法

一、研究对象

选取2013年10月至2015年1月期间在本中心行体外受精／卵胞浆内单精子注射-胚胎移植（IVF／ICSI-ET）的110 例time-lapse 培 养 周 期 和2 274 例常规IVF胚胎培养周期的临床结果。纳入标准：因女方输卵管因素、男方少弱畸精子症、梗阻型无精子症以及其他因素在我中心接受IVF／ICSIET 助孕治疗的不孕不育患者。所有入选周期排除了女性子宫因素（如子宫肌瘤、子宫内膜异位症等）以及其他疾病因素（卵巢储备功能下降、染色体臂间倒位、多囊卵巢综合征等）。

所有入选周期受精数≥6 个，同时由于Primo Vision 胚胎培养皿（Vitrolife，瑞典）最多只能放置16个胚胎，所以所有入选周期受精数≤16个。实验中所有患者被随机分配成time-lapse 组和常规IVF组。

二、方法

1.超排卵方案：采用标准长方案和短方案进行。

2.精液处理：精液液化后，行IVF 的精液经非连续密度梯度离心法处理后，在受精液（G-IVF Plus，Vitrolife，瑞典）中上游1h后备用；行ICSI的精液经胚胎缓冲液（G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典）直接离心后备用。受精前按照WHO 标准［8］，分别检测精液量，以及精子浓度和活动率。

3.IVF／ICSI：注射人绒毛膜促性腺激素（HCG，Merck Serono，德国）36h后经阴道B 超引导下取卵，根据临床指征行IVF 或ICSI。IVF 授精：分别将精子、卵母细胞加入到受精培养液滴中进行受精。ICSI授精：卵母细胞经过透明质酸酶（Sigma，美国）剥除颗粒细胞后，转移至G-MOPS Plus 滴中行ICSI。

4.胚胎培养：受精观察后，常规组将正常受精胚胎转移至卵裂培养滴（G-1Plus，Vitrolife，瑞典）并置于Thermo Forma培养箱中37°C、6%CO2条件下培养；time-lapse组将正常受精胚胎转移至含卵裂培养滴并置于Thermo Forma培养箱内的Primo vision胚胎监测仪器（Vitrolife，瑞典）中37 ℃、6%CO2条件下培养。

5.胚胎质量评估：常规组胚胎体外培养至第3天（D3），根据细胞数目、卵裂球的形态、均一度以及碎片进行评分。优质胚胎评价参照本生殖中心标准［9］。time-lapse组胚胎体外培养至D3，Primo vision分析系统（Vitrolife，瑞典）根据胚胎发育过程中每个事件的发生时间并结合D3形态学对胚胎进行评分。胚胎发生事件包括：第1 次卵裂时间（＜45min）、2细胞出现时间（20～32h）、2～3细胞的时间（8～12h）、3 细胞出现时间（31～42h）、3～4细胞的时间（＜75 min）、4 细胞出现时间（35～44h）、4～5细胞的时间（13～16h）、5细胞出现时间（49～57h）等。

6.胚胎移植和妊娠检查：选择评分最高的2～3枚胚胎进行移植，以移植后4～6周阴道B超下出现孕囊和胎心为临床妊娠。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行处理。均数比较采用t检验，率之间比较采用卡方检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、比较time-lapse培养和常规IVF 胚胎培养对受精个数≤10周期临床结果的影响

本研究共110例time-lapse培养周期和2 274 例常规IVF胚胎培养周期，所有入选周期的受精卵为6～16个，根据中位数划分为受精卵＞10的周期（多胚胎周期）和受精卵≤10的周期（非多胚胎周期）。

其中65例time-lapse培养周期和1 618例常规IVF培养周期的受精个数介于6～10个。两组的基本情况：年龄［（31.5±4.0）岁vs.（31.0±4.2）岁，P＞0.05］、体重指数（BMI）［（21.1±2.7）kg／m2vs.（21.5±2.9）kg／m2，P＞0.05］、不 育 年 限［（4.0±3.4）年vs.（3.8±2.7）年，P＞0.05］、原发不育率（32.3% vs.39.9%，P＞0.05）；两组授精方 式：ICSI（15.4% vs.21.7%）、IVF （80.0% vs.67.9%）、IVF／ICSI（4.6% vs.10.4%），均无显著性差异（P＞0.05）。

两组获卵数、成熟数、受精数、卵裂数、D3优质胚胎数、优质胚胎率、ET 数、以及种植率和临床妊娠率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

二、比较time-lapse培养和常规IVF 胚胎培养对受精数＞10周期临床结果的影响

共45个time-lapse培养周期和656 个常规培养周期的受精个数介于11～16。两组的基本情况：年龄［（31.6±4.2）岁vs.（30.5±4.0）岁，P ＞0.05］、BMI［（21.0±2.5）kg／m2vs.（21.6±3.0）kg／m2，P＞0.05］、不 育年限［（3.9±3.3）年vs.（3.9±2.8）年，P＞0.05］、原发不育率（26.7%vs.39.6%，P＞0.05）；两组授精方式：ICSI（28.9%vs.18.9%），IVF （64.4% vs.70.7%），IVF／ICSI（6.7%vs.10.4%），均无显著性差异（P＞0.05）。

两组之间获卵数、成熟数、受精数、卵裂数、D3优质胚胎数、优质胚胎率、ET 数，差异均无统计学意义（P＞0.05）。但time-lapse培养周期的种植率和临床妊娠率显著高于常规培养周期（P＜0.05）（表2）。

表1 受精数≤10的time-lapse培养周期和常规培养周期临床结果［（±s），（%）］

表1 受精数≤10的time-lapse培养周期和常规培养周期临床结果［（±s），（%）］

注：两组比较，P 均＞0.05

组 别 周期数（个） 获卵数（个） 成熟数（个） 受精数（个） 卵裂数（个）time-lapse培养周期65 11.8±3.2 10.5±2.7 7.8±1.3 7.5±1.3常规培养周期 1 618 12.1±3.4 10.6±2.7 7.8±1.4 7.6±1.5组 别 D3优胚数（个） D3优胚率 ET 数（个） 种植率 妊娠率time-lapse培养周期2.9±2.1 37.3 2.4±0.5 30.1 47.7常规培养周期2.6±1.9 34.3 2.3±0.4 35.4 55.5

表2 受精数＞10的time-lapse培养周期和常规培养周期临床结果［（±s），（%）］

表2 受精数＞10的time-lapse培养周期和常规培养周期临床结果［（±s），（%）］

注：与timp-lapse培养周期比较，＊P＜0.05

组 别 周期数（个） 获卵数（个） 成熟数（个） 受精数（个） 卵裂数（个）time-lapse培养周期45 17.1±2.9 15.6±2.7 13.0±1.9 12.2±2.6常规培养周期 656 17.4±3.6 15.9±3.0 12.6±1.6 12.2±1.8组 别 D3优胚数（个） D3优质胚胎率 ET 数（个） 种植率 妊娠率time-lapse培养周期4.5±2.7 37.0 2.1±0.3 56.8 77.8常规培养周期 4.3±4.2 35.6 2.1±0.3 40.0＊ 57.5＊

讨 论

本研究回顾性分析了2013年10月至2015年1月期间在本中心行IVF／ICSI-ET 的110例timelapse培养周期和2 274 例常规IVF 胚胎培养周期的临床结果。我们分别比较time-lapse培养和常规IVF胚胎培养对受精数≤10或＞10周期临床结果的影响。研究发现当受精数≤10 时，time-lapse培养周期和常规培养周期的种植率、临床妊娠率无显著性差异，而当受精数＞10时，time-lapse周期的种植率（56.8% vs.40.0%）和 临 床 妊 娠 率（77.8%vs.57.5%）均显著高于常规培养周期（P＜0.05）。

随着辅助生殖技术的发展，time-lapse仪器作为一种新的设备开始在各个临床中心运用。Timelapse可以在保持胚胎培养条件稳定的情况下，通过每天24h连续非侵入性的胚胎观察，捕捉胚胎发育过程中形态学的动态变化并进行摄影成像［10-12］。最后通过软件对胚胎各个发生事件的时间进行标记、记录卵裂异常等行为，进行分析后挑选胚胎移植。虽然time-lapse技术中平均每个胚胎需要在LED 光线下暴露约300次／d，但实际上总暴露时间小于50s／d，在过去的5～6年里，大量的研究已经确认了time-lapse技术的安全性［13-14］。现今，各个中心主要使用Primo vision、Embryoscope、EEVA三种time-lapse监测系统［15］。本研究采用Primo vision监测系统，可以监测扫描11 个聚焦平面，最短可保持每5min进行一次图片记录，这非常有利于准确捕捉胚胎一些动态变化（比如，原核消失到2细胞的时间为30～35min）。

至今，尚无足够的研究证实运用time-lapse培养相比常规培养有可以获得更高的临床妊娠率和出生率。Siristatidis等［16］采用time-lapse培养技术获得了比常规培养更高的临床妊娠率、继续妊娠率和出生率，尤其当女性年龄＞40岁时，显著性更加明显。Azzarello等［17］运用time-lapse观察原核形态、记录原核消失时间，发现原核消失时间迟于20h45 min 的胚胎其种植率显著高于原核消失早于20h 45min 的胚胎。而Cruz等［14］则比较time-lapse培养和常规培养的胚胎质量、囊胚形成率、临床妊娠率等指标，发现两者之间无统计学差异。Lemmen等［18］使用time-lapse系统培养102枚正常受精卵，发现D2时58%的胚胎到达4细胞阶段，82%的胚胎可用于移植或冷冻，这同常规培养相比无统计学差异。本研究中，当受精数≤10时，time-lapse培养和常规培养的临床结局无统计学差异，但当受精数＞10时，time-lapse培养的临床妊娠率、种植率显著高于常规培养。我们分析认为：当受精数≤10 个时，time-lapse培养周期和常规培养周期的优质胚胎数分别为（2.9±2.1）个和（2.6±1.9）个，根据临床指征通常胚胎移植时需2～3枚胚胎，常规培养周期通过D3形态学评分可以选择出仅有的2～3枚优质胚胎进行移植，而time-lapse培养周期运用D3形态学评分结合早期胚胎发生事件时，由于优质胚胎往往卵裂时间和行为异常率远远低于低质量胚胎，而且形态学本身就是个重要参考，因而timelapse挑选的优势不是很明显；而当受精数＞10时，time-lapse和常规培养周期的优质胚胎数分别为（4.5±2.7）个和（4.3±4.2）个，形态学评分无法很好选择最优2～3枚胚胎进行移植，此时运用timelapse技术结合胚胎早期发生事件，可以避免移植那些D3形态学评分优级但早期出现卵裂行为异常、卵裂时间异常以及出现多核细胞的胚胎。

此外，有研究［19］认为time-lapse培养相对普通培养可以避免培养箱频繁的开关，保持培养箱内环境尤其是pH 和温度的稳定，有利于获得高质量的胚胎。但本研究中，无论受精数≤10或者＞10的周期，time-lapse培养和常规培养的优质胚胎数、优质胚胎率均无统计学差异。因此，我们认为受精数＞10的time-lapse培养周期相对于常规培养周期的高种植率和高临床妊娠率主要是通过优选高发育潜能胚胎进行移植而非提高胚胎质量方式完成的。目前time-lapse挑选时参考的早期事件主要包括卵裂细胞出现的时间和维持时间以及卵裂异常和多核等异常行为。本研究主要采用1～5卵裂球细胞出现的时间和维持时间以及是否出现多核、卵裂异常等参数来判断胚胎的发育潜能。这些参数在常规培养周期中无法观察到，但在很多研究中证实是有利于胚胎筛选的。Meseguer等［20］分析认为，5细胞出现时间、3～4 细胞的时间、2 细胞出现的时间，以及2～3细胞的时间有助于筛选高种植率的胚胎。Basile等［21］通过研究多中心的time-lapse数据，发现3细胞出现时间、5细胞出现时间、2～3细胞的时间与胚胎种植存在相关性，而多核、异常卵裂的胚胎发育潜能不高。

本研究证实，受精数＞10 的周期通过timelapse培养可以获得比常规培养周期更高的临床妊娠率和种植率。当然本研究的样本量比较少，同时仅仅以胚胎种植、临床妊娠作为统计结局。下一步，我们考虑扩大样本量，并增加囊胚形成、出生率等指标证实本结论。

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