固定化混合菌处理含油废水优化实验

韩志勇，屈波，张东旭，张利军，李玲

(兰州理工大学 石油化工学院，甘肃 兰州 730050)

石油在其开采、运输、加工和使用过程中产生的污染物会对生态环境和人类健康存在潜在的威胁［1］，其主要污染物有n-烷烃(TNA)、放射性物质、苯、酚类化合物、腐殖酸和多环芳烃(PAHs)［2-3］。核桃壳具有坚韧性大、耐磨抗压、吸附能力强、抗油浸、不含有毒物质、在酸、碱和水中溶解度很小、进入水体不会引起水质恶化等优点［4-5］，是油田、冶炼、环保化工等行业含油污水处理的理想材料。

固定化生物技术是采用物理或化学手段将游离细胞或酶限定于一定空间内，使其保持活性并可反复利用的一种方法［6］，已成功应用在水、大气和土壤污染防治领域，尤其对生物难降解有机物［7-9］、高浓度有机废水［10-11］和大气中H2S、NOX和SOX［12-14］均有较好的处理效果。

本研究选用核桃壳作为生物载体，探索固定化微生物降解原油的最佳条件，以期为固定化微生物技术处理石油烃类污染物提供一定的科学依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

蛋白胨、酵母粉、NaCl、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、Fe2(SO4)3、MnSO4·H2O、ZnSO4·H2O、CaCl2均为分析纯;耐低温石油降解菌JA 和JB(从长庆油田长期受石油污染土壤中筛选和驯化);核桃壳(粉碎至12 ～22 目)。

SKY-200B 恒温培养振荡器;SW-CJ-2F 型生物洁净工作台;DNP-9082 恒温培养箱;PHS.3C 精密pH 计;AB204-L 型分析天平;UV-2010PC 紫外可见分光光度计;YXQGOZ 型电热式蒸汽消毒器。

1.2 培养基配制

1.2.1 原油培养基 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，原油1 mL，蒸馏水1 L，调节pH 值为7.5。

1.2.2 无机盐培养基 NH4Cl 0.511 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0. 03 g，Fe2(SO4)30. 03 g，MnSO4·H2O 0. 04 g，ZnSO4·H2O 0. 05 g，CaCl20.01 g，蒸馏水1 L，调节pH 值为7.5。

1.2.3 基础培养基 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 L，调节pH 值为7.5。配制固体培养基需加入18 ～20 g 琼脂。

1.3 固定化混合菌的制备

称取一定量的核桃壳，放入锥形瓶，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min，冷却后，加入50 mL 活化17 h的混合菌液，于180 r/min 摇床中15 ℃恒温固定24 h。过滤，用无菌生理盐水清洗3 次，即得到固定化混合菌。

1.4 实验方法［6，16］

在50 mL 无机盐培养基中加入2.0 g JA 和JB复配比1 ∶2 的固定化菌，pH 7. 5，原油质量浓度5 g/L 条件下，于180 r/min 摇床中15 ℃恒温降解5 d。采用超声-索氏萃取-重量法［17］测定原油降解率。

式中 R——原油降解率，%;

m1——无机盐培养基中原油质量g;

m2——5 d 后原油质量，g。

2 结果与讨论

2.1 混合菌复配比

在50 mL 无机盐培养基中加入2.0 g 固定化菌，在pH 值为7.5、温度15 ℃、原油质量浓度5 g/L条件下，考察JA 和JB 复配比例对R 的影响，结果见图1。

图1 固定化菌复配比对原油降解效果的影响Fig.1 Effect of immobilized bacteria complex ratio on crude oil degradation result

由图1 可知，对原油的降解能力复配菌均高于单菌，JA 和JB 的生物量以1∶2 复配后，原油降解率达到63.92%，均高于1∶1 和2∶1 配比时的原油降解率。这是由于菌株按比例复配后，有利于发挥菌株互助作用，从而提高原油降解率［18］，因此选择菌株复配比例为1∶2 进行后续实验。

2.2 原油质量浓度的影响

在50 mL 无机盐培养基中加入2.0 g JA∶JB=1∶2的固定化复配菌，在pH=7.5、温度15 ℃的条件下，研究原油质量浓度对原油降解率的影响，结果见图2。

图2 原油质量浓度对原油降解率的影响Fig.2 Effect of crude oil initial mass concentration on the degradation rate of crude oil

由图2 可知，当原油质量浓度＜4 g/L 时，原油降解率随着原油浓度的增加而直线上升;当原油浓度＞4 g/L 时，原油降解率降低。这是由于原油浓度不高时，培养液中底物浓度的增加可以促进菌株生长，从而提高了原油降解率。原油浓度过高，会降低原油在溶液中的分子扩散性能，并抑制菌株的生长繁殖，从而对原油的降解效果下降。选择原油质量浓度为4 g/L 进行后续实验。

2.3 pH 值的影响

在50 mL 无机盐培养基中，加入2.0 g JA∶JB=1∶2 固定化复配菌，在原油质量浓度4 g/L、温度15 ℃的条件下，考察pH 值对原油降解率的影响，结果见图3。

图3 pH 对原油降解率的影响Fig.3 Effect of pH value on the degradation rate of crude oil

由图3 可知，当pH ＜7.5 时，原油降解率随着pH 的上升而增加;当pH ＞7.5 时，原油降解率随着pH 的上升而降低。这是由于pH 过高或过低，均会影响细胞酶的稳定性和细胞酶活性中心重要基团的解离状态及原油基团的解离状态，从而降低细胞代谢能力［18］。在pH 7.5 时细胞酶表现出最高的催化活性，促进细胞对原油的代谢，使原油降解率达到最高。

2.4 固定化混合菌投加量的影响

在50 mL 无机盐培养基中加入固定化复配菌，在原油质量浓度4 g/L、pH=7.5、温度15 ℃的条件下，考察固定化混合菌投加量对原油降解率的影响，结果见图4。

图4 固定化混合菌投加量对原油降解率的影响Fig.4 Effect of immobilized mixed bacteria dosage on the degradation rate of crude oil

由图4 可知，当固定化混合菌投加量＜30 g/L时，随着固定化混合菌投加量的增大，原油降解率升高;固定化混合菌投加量＞30 g/L 时，原油降解率下降。当固定化混合菌投加量低时，固定化微生物量较少，培养基为微生物提供了充足的营养物质，促进微生物的生长繁殖;随着固定化混合菌投加量的不断增大，固定化微生物量也逐渐增加，微生物之间为争夺营养物质而产生竞争和抑制关系，使原油降解率下降。

2.5 固定化时间的影响

在50 mL 无机盐培养基中加入2 g 固定化微生物，在原油质量浓度4 g/L、pH 值为7.5、温度15 ℃的条件下，考察微生物固定化时间对原油降解率的影响，结果见图5。

图5 固定化时间对原油降解率的影响Fig.5 Effect of immobilizing time on the degradation rate of crude oil

由图5 可知，固定化时间＜24 h，随着固定化时间的增加，原油降解率逐渐增大;固定化时间为24 h时，原油降解率达到最大值;而24 h 后，随着固定化时间的增加，原油降解率反而下降。这是由于初始阶段，核桃壳有效孔隙率较大，固定化微生物量不断增大;当固定时间超过24 h 时，核桃壳孔隙中微生物过于密集，影响微生物活性的发挥，使原油降解率缓慢降低。

2.6 响应面优化实验［20-21］

依据单因素实验结果，按Box-Behnken 设计实验，其因素和水平见表1，结果见表2。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

表2 实验结果Table 2 Result of experiment

运用多元回归分析方法对表2 数据拟合，可得原油降解 率模型:Y = 66. 54 + 4. 88A + 5. 03B－4.70C + 6. 44D－0. 93AB + 6. 32AC + 6. 19AD－4.49BC+2.98BD +4.83CD－12.64A2－13.60B2－10.90C2－14.23D2。

对响应面二次模型方差分析和可信度估计及进行F 检验，结果见表3。

表3 响应面模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface model

由表3 中模型的显著系数(p ＜0.000 1)和失拟项显著系数(p=0.124 4)可知，该模型可以准确的预测不同组合条件下的原油降解率。该模型的复相关系数R=0.983 4，表明预测值和实测值的拟合度较高，可用于实际值的分析［19］;Radj2=0.934 2 说明只有6.58%的变异不能通过该模型解释，所以可以用预测值代替实测值对实验结果进行分析和预测。除原油质量浓度和pH 值、固定化时间和pH 值的交互作用不显著，其他所有回归系数都是显著的。其中，单因素对原油降解率的影响程度由高到低的顺序为固定化时间、pH 值、原油质量浓度和固定化混合菌投加量;交互作用对原油降解率的影响程度由高到低的顺序为原油质量浓度和固定化混合菌投加量、原油质量浓度和固定化时间、固定化混合菌投加量和固定化时间、pH 值和固定化混合菌投加量。通过Design Expert 8.0.6 软件，将4 因素两两进行分析比较，做出响应面曲线图，见图6 ～图11。

图6 原油初始质量浓度和pH 值对原油降解率的交互影响图Fig.6 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the mass concentration of crude oil and the pH value

图7 原油初始质量浓度和固定化混合菌投加量对原油降解率的交互影响图Fig.7 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the mass concentration of crude oil and the dosage of immobilized mixed bacteria

图8 原油初始质量浓度和固定化时间对原油降解率的交互影响图Fig.8 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the mass concentration of crude oil and the immobilizing time

图9 pH 值和固定化混合菌投加量对原油降解率的交互影响图Fig.9 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the pH value and the dosage of immobilized mixed bacteria

图10 pH 值和固定化时间对原油降解率的交互影响图Fig.10 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the pH value and the immobilizing time

图11 固定化混合菌投加量和固定化时间对原油降解率的交互影响图Fig.11 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the dosage of immobilized mixed bacteria and the immobilizing time

2.7 预测模型的验证

为得到最优降解条件，借助Matlab 软件对模型求解，得到固定化混合菌在原油质量浓度4 300 mg/L，pH 值7. 9，固 定 化 混 合 菌 投 加 量27 g/L，微生物固定化时间28.5 h 时，理论最大原油降解率为68.89%。为了验证模型的准确性，用最佳降解条件进行3 次平行实验，得到固定化微生物对原油的平均降解率为69.94%，可见该模型能够准确的预测实际降解条件。

3 结论

低温石油降解菌JA 和JB 对原油均具有良好的降解能力。固定化混合菌能显著提高微生物对原油的去除效果，固定化混合菌降解原油的最佳工艺条件为:原油质量浓度4 300 mg/L，pH 值7.9，JA∶JB=1∶2，固定化混合菌投加量27 g/L，固定化时间28.5 h，在该条件下，15%处理5 d 后，原油的降解率为69.94%。

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