葡萄酒中几种防腐剂的固相萃取离子色谱测定法

解彦平，胡平，何燕，郭爱静

(石家庄市疾病预防控制中心，河北 石家庄 050000)

食品添加剂的滥用已经成为食品安全的重要威胁。我国国家标准GB 15037—2006《葡萄酒》规定:葡萄酒中不得添加合成着色剂、甜味素、香精、增稠剂，同时对防腐剂也有明确限制。葡萄酒中常见的防腐剂有苯甲酸钠、山梨酸、亚硝酸盐和二氧化硫［1-2］。几乎所有种类的葡萄酒都含有一定量的亚硝酸盐，它的含量对人体也产生重要的影响;SO2作为细菌抑制剂和抗氧化剂对葡萄酒的酿制有很大作用，但SO2含量过高，饮用后会对人体造成伤害［3-4］;柠檬酸通常被用来增加葡萄酒的酸度［5-6］，用量不当影响口感。因此，葡萄酒中的添加剂含量一直属于葡萄酒检测中监控的项目。

目前，国内葡萄酒中添加剂的检测，主要借鉴和使用饮料或配制酒的检验方法［7-8］。但是，由于葡萄酒的化学成分远比配制酒复杂，利用配制酒检验中的高效液相色谱(HPLC)法检测葡萄酒中的合成色素、防腐剂和甜味剂往往导致检测误差偏大、灵敏度下降。

本文采用自动淋洗-电导抑制离子色谱法，离子交换固相萃取柱净化，操作简便、快速，精密度和准确度均符合要求，可实现多组分同时分析，节约成本，提高效率。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

二氧化硫标准(环境保护部标准样品研究所，GSB 07-1273—2000，浓度为100 μg/mL);山梨酸标准物质溶液(GBW(E)100007，国家标准物质中心，浓度为1 000 μg/mL);苯甲酸标准物质溶液(GBW(E)100006，国家标准物质中心，浓度为1 000 μg/mL);亚硝酸盐标准物质溶液(GSB 05-1142—2000，环境保护部标准样品研究所，浓度100 mg/L);柠檬酸(99.5%);甲醇，色谱纯;实验用水均为超纯去离子水。

ICS-2000 型离子色谱仪:EG50 淋洗液发生器;AS50 自动进样器;ASRSⅡ4 mm 阴离子抑制器;电导检测器;Chromeleon 6.5 色谱工作站;T-460/H 微波超声振荡器;SiGM2-16 希格玛离心机;Advantage A10 型超纯水机;0. 22 μm 微孔滤膜;DIONEX On GuardⅡP、On GuardⅡRP 固相萃取柱。

1.2 色谱条件

色谱柱为IonPacAS Ⅱ-HC 型阴离子分析柱(4.0 mm×250 mm)，IonPacAGⅡ-HC 型阴离子保护柱(4.0 mm×50 mm)，抑制器ASRS(4 mm)，抑制器电流65 mA，淋洗液为26 mmol/L 的KOH 溶液，流速1.0 mL/min，进样体积25 μL，柱温30 ℃。

1.3 实验方法

1.3.1 固相萃取柱准备［9］分别用10 mL 甲醇和活化10 mL 的水DIONEX On GuardⅡRP 柱和On Guard ⅡP 前处理柱，活化过程中注意控制流速，甲醇和水逐滴滴下，使固相萃取小柱充分活化，将小柱平放20 min，备用。

1.3.2 样品测定 量取一定量葡萄酒样品于锥形瓶中，加入超纯去离子水，稀释一定的倍数，于微波超声振荡器上常温振荡10 min，以3 000 r/min 离心5 min。取上清液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤。过相连接的DIONEX On GuardⅡP、On GuardⅡRP 固相萃取柱，控制同样的滴速，弃去前3 mL 滤液，剩余2 mL滤液直接进样进行测定。同时做空白实验。

2 结果与讨论

2.1 取样量的选择

葡萄酒中几种防腐剂的含量不均，为了达到好的检出效果，取样量很关键。取样量大，样品前处理困难，由于前处理所用的固相萃取小柱柱容量一定，当待测样品中各种成分含量均高时，会影响分离效果和降低柱效;取样量小，待测组分含量过低，影响检测的准确性。经过多次实验，最终选择取样量为5.0 mL 适宜。

2.2 葡萄酒样品前处理

葡萄酒样品成分复杂，含有较多的色素和糖类，这些多羟基或酚基弱酸物质在强碱性的KOH 淋洗体系中能部分或完全电离，强吸附于保护柱和分离柱，严重影响色谱柱的柱效和寿命，因此选择合适的前处理方法。蛋白质、树脂、聚合物、色素都使酒具有胶体溶液的性质，同时也是酒中的不稳定因素，为了改善定性定量的准确性和重复性，选用基质为二乙烯基苯高聚物的OnGuardⅡ固相萃取柱，可选择性吸附样品基体中的疏水性化合物，实现样品的有效净化。RP 柱还起到过滤作用，稍浑浊或有少量杂质的样品，过柱后样液更清澈，有利于样品分析和色谱柱保护［10］。

2.3 淋洗液条件的选择

为了使几种组分能很好的分离，采用梯度洗脱，但由于背景电导高，使方法的检出限大大增高。所以改为等度洗脱，分别用15，20，26，35 mmo/L 浓度淋洗液进行等度淋洗，结果显示，15，20 mmo/L KOH条件下标准品出峰时间较慢，用35 mmo/L KOH 进行等度洗脱，各峰之间的分离度不佳。用26 mmo/L KOH 浓度洗涤，基线漂移小，保留时间稳定性高，色谱峰分离度好，峰形对称，重现性优，分析时间短。

2.4 色谱行为

对5 种防腐剂(亚硝酸盐、山梨酸、苯甲酸、二氧化硫、柠檬酸)的混合标准液和样品溶液平行进样7 次，结果见图1。

图1 五种防腐剂混标(a)和葡萄酒样品的色谱图(b)Fig.1 Chromatogram of standard solution(a)and sample solution (b)a.五种防腐剂混标;b.葡萄酒加标试样

由图1 可知，5 种防腐剂的峰形对称、基线平稳，均能得到良好分离，分离度均＞1.2。

2.5 标准曲线和检出限

配制5 种防腐剂的标准系列溶液，按色谱条件分析，以峰面积对浓度作回归，得到5 种组分的线性范围和相关系数等指标。用浓度稀释法测得5 种防腐剂相对应的检出限，结果见表1。

表1 5 种防腐剂指标Table 1 Parameters of 5 preservatives

2.6 方法的精密度

对几种添加剂标准溶液进行7 次重复测定，结果见表2。

由表2 可知，5 种防腐剂的相对标准偏差在0.5% ～1.5%，表明精密度良好，满足测定要求。

表2 精密度测定Table 2 Precision tests

2.7 方法的准确度

对本底值较低的葡萄酒样品进行加标回收实验，重复测定7 次，结果见表3。

表3 实际样品测定及加标回收结果Table 3 Results of recovery and determination of samples

由表3 可知，5 种防腐剂的平均回收率为90.0% ～99.0%，均可满足实验要求。

3 结论

采用固相萃取-离子色谱测定葡萄酒多种防腐剂，并结合固相萃取的样品前处理技术，相对于其它常规方法，具有步骤和操作简便、精密度和灵敏度高、对环境无污染、检测结果准确等优点，适用于批量葡萄酒样品中多组分的测定分析。

［1］ 徐咏薇，李静，刘红英.液态食品中三种甜味剂和两种防腐剂的离子色谱法［J］. 环境与健康杂志，2010，27(6):530-532.

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［5］ 胡平，刘贺彬，任永红.离子色谱法测定饮料中的柠檬酸盐［J］.现代科学仪器，2008(5):70-72.

［6］ 谢晓烽，姚永青，李培，等. 离子色谱法测定葡萄酒柠檬酸含量［J］.科技资讯，2011(2):96-97.

［7］ 王爱月，卢素格，翟志雷.离子色谱法同时测定饮料中五种添加剂的方法研究［C］∥第13 届离子色谱学术报告会论文集.青岛:中国仪器仪表学会，2011.

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［10］秦含章.葡萄酒分析化学［M］.北京:中国轻工业出版社，1991:253-263.