探讨雷公藤甲素对BALB/c哮喘小鼠IL-23/Th17(IL-17)炎症轴的影响①

杨志明　成俊芬陈鸣娣梁一波(肇庆市第一人民医院，肇庆526020)



探讨雷公藤甲素对BALB/c哮喘小鼠IL-23/Th17(IL-17)炎症轴的影响①

杨志明成俊芬②陈鸣娣②梁一波②(肇庆市第一人民医院，肇庆526020)

［摘要］目的:观察雷公藤甲素对哮喘小鼠IL-23、Th17细胞及其细胞因子IL-17表达的情况，探讨其对Th17细胞介导的哮喘气道炎症的影响及其作用机制，为雷公藤甲素治疗哮喘提供作用靶点。方法: SPF级BALB/c小鼠32只，随机分为正常组(NC组)、哮喘组(A组)、哮喘雷公藤甲素干预组(TA组)和哮喘地塞米松干预组(DA组)，每组8只。哮喘组以卵白蛋白和氢氧化铝致敏;卵白蛋白滴鼻吸入激发。雷公藤甲素干预组及地塞米松干预组致敏及激发方法均同哮喘组，这两组在每次激发前30 min分别予腹腔注射雷公藤甲素及地塞米松，正常对照组致敏与激发均以生理盐水代替。细胞计数器计算肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及嗜酸性粒细胞的数目;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠BALF IL-23，IL-17的含量; HE染色观察小鼠肺组织病理变化;免疫组化法检测肺组织IL-17蛋白表达水平; qRT-PCR检测右肺组织中IL-17mRNA的表达;流式细胞仪检测外周血Th17细胞占CD4+T淋巴细胞百分率。结果:哮喘组肺泡灌洗液(BALF)中白细胞(WBC)、嗜酸性粒细胞(Eos)、IL-23、IL-17的含量、肺组织中IL-17蛋白及IL-17 mRNA表达、外周血Th17细胞占CD4+T细胞的比率均高于对照组(P＜0.05)，雷公藤甲素干预组和地塞米松干预组中上述各指标低于哮喘组(P＜0.05) ;雷公藤甲素干预组与地塞米松干预组上述各指标间差异无显著性(P＞0.05)。结论:雷公藤甲素可抑制哮喘气道炎症，其作用机制可能通过抑制IL-23/Th17(IL-17)炎症轴实现。

［关键词］雷公藤甲素;哮喘; Th17细胞; IL-23; IL-17

①本文为广东省科技计划项目(No.2012B031800446)。

②广东医学院第二附属医院，湛江524003。

To explore effects of triptolide on IL-23/Th17(IL-17) inflammatory axis in asthmatic BALB/c mice

YANG Zhi-Ming，CHENG Jun-Fen，CHEN Ming-Di，LIANG Yi-Bo.The First People's Hospital of Zhaoqing City，Zhaoqing 526020，China

［Abstract］Objective: To observe the effect of triptolide on asthmatic mice IL-23，Th17 cells and their cytokine IL-17 expression，and to explore its effect on Th17 cell-mediated airway inflammation，and its mechanism of action，which provides targets for triptolide in treatment of asthma.Methods: 32 SPF level BALB/c mice were randomly divided into normal control group(NC)，asthmatic group(A)，triptolide group(TA group) and dexamethasone group(DA group)，n=8.Asthmatic group with ovalbumin sensitization and aluminum hydroxide; ovalbumin intranasal inhalation challernge.Mice of triptolide group and dexamethasone group were sensitized and challenged as asthmatic group，and the two groups were respectively given triptolide and dexamethasone by intraperitoneal injection 30 minutes before challenged.Mice of control group was sensitized and challenged by saline.The total number of white blood cells and the number of eosinophils of BALF were calculated by cell counter.IL-23 and IL-17 levels in BALF were measured by ELISA.Lung tissue were stained with hematoxyin and eosin(HE) .IL-17 protein expression levels were detected by immunohistochemistry in lung tissue，and the mRNA expression levels of right lung tissue were detected by qRT-PCR.Th17 percentage of CD4+T lymphocytes were analyzed by flow cytometry.Results: Numbers of white blood cells(WBC) and eosinophils(Eos) of BALF，IL-23 and IL-17 levels of BALF，IL-17 protein and IL-17 mRNA expression in lung tissue，and Th17 cell frequencies in peripheral blood were all significantly increased in the asthmatic group compared to the control group(P＜0.05)，but reduced significantly in triptolide group and dexamethasone group compared to asthmatic group; there was no significant difference in the above mentioned indicators between in triptolide group and dexamethasone group(P＞0.05) .Conclusion: Triptolide can inhibit airway inflammation，which mechanism is possible by inhibiting IL-23/ Th17(IL-17) inflammatory axis.

［Key words］Triptolide; Asthma; Th17 cells; IL-23; IL-17

支气管哮喘是由多种细胞包括气道的炎症细胞和结构细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。在支气管哮喘免疫-炎症学说机制方面，目前普遍认为，Th2型占优势的Th1/Th2型免疫应答失衡，是支气管哮喘慢性气道炎症形成的基础。然而，Th1/Th2型免疫应答失衡不能完全解释哮喘的一些临床及病理生理现象。最近发现Th17细胞及效应细胞因子IL-17在哮喘特别是重症哮喘的发病中起着重要作用，可介导嗜酸性粒细胞及中性粒细胞性气道炎症，同时在气道高反应性、气道重塑中发挥重要作用。研究表明，IL-17受体基因敲除的小鼠在OVA激发后气道内嗜酸性粒细胞浸润减轻、气道高反应性减弱并伴随Th2型细胞因子IL-4、IL-5水平下降［1］。Wakashin等［2］通过继转移实验发现，抗原特异性Th17细胞被转移到致敏小鼠身上，Th17细胞就能显著增强抗原诱导嗜酸性气道炎症。IL-23是IL-12家族的其中一员，IL-23对维持Th17细胞稳定和促进Th17细胞增殖有重要作用［3］，从而构成IL-23/ Th17(IL-17)炎症轴系。研究表明，L-23/Th17(IL-17)在哮喘的发生发展起重要作用，能促进嗜酸性粒细胞性气道炎症及中性粒细胞性气道炎症。

雷公藤甲素(Triptolide TL，又叫雷公藤内酯醇)是从雷公藤中分离出来的二萜类化合物，是雷公藤中抗炎和免疫调节的重要有效成分。自1987年来茶云［4］等首次报道应用雷公藤多甙治疗重型、偏重型小儿支气管哮喘之后，掀开了对雷公藤多甙等雷公藤提取物在哮喘病防治方面的基础、临床研究的序幕。大量研究表明，雷公藤及其提取物可抑制哮喘慢性炎症的发生。目前关于雷公藤及其提取物对Th17细胞及其效应细胞因子影响的研究报道甚少。Wang等［5］体外细胞研究发现，雷公甲素可抑制Th17细胞的分化，随后王敏等［6］体外研究也得到类似的结果。然而关于雷公藤制剂也是否能抑制哮喘患者或哮喘模型体内Th17细胞的分化以及其效应细胞因子IL-17，此类的研究目前尚未见报道。本研究通过建立BABL/c哮喘模型小鼠，观察雷公藤甲素对IL-23/Th17(IL-17)炎症轴系的影响，探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠32只，体重18～22 g(广东医学院实验动物中心提供)饲养于符合SPF级实验动物环境中，喂养不含致敏原的饲料及纯净水。

1.2分组随机分为正常对照组(NC组)、哮喘组(A组)、哮喘雷公藤甲素干预组(TA组)和哮喘地塞米松干预组(DA组)，每组8只，分笼饲养。

1.3主要试剂与设备卵白蛋白(OVA美国Sigma，纯度＞98%) ;氢氧化铝粉末(广东光华化学厂有限公司) ;地塞米松注射液(广州侨光制药厂) ;雷公藤甲素(Triptolide广州牌牌生物有限公司，纯度＞99.78%) ; Anti-IL-17 bs-1183R(北京博奥森生物技术有限公司) ; Mouse IL-17 ELISA Kit 96T(上海劲马设备有限公司) ; IL-17 PCR引物(上海生工生物工程有限公司) ;抗小鼠单克隆抗体mAb-anti-CD4－FITC、anti-IL-17-PE及其相匹配的同型对照(均购自eBioscience公司) ; LightCycler 480 II实时定量PCR仪(瑞士Roche公司) ; FACS流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4试验方法

1.4.1哮喘模型的建立参照沈华浩［7］的《支气管哮喘小鼠模型应用评价》进行模型制备，哮喘模型于实验的第0、7、14天腹腔注射400 μl致敏液(含OVA 50 μl，Al(OH)31 mg)致敏;第21天起均给予2 mg/ml OVA-NS溶液滴鼻吸入激发，每天1次，连续激发5 d。雷公藤干预组及地塞米松干预组致敏及激发方法均同哮喘组，在每次激发前30 min雷公藤干预组给予腹腔注射雷公藤甲素40 μg/kg进行干预，地塞米松干预组给予腹腔注射地塞米松2 mg/kg进行干预［5］。正常对照组致敏与激发均以生理盐水代替。

1.4.2 BALF的收集处理最后1次激发后24 h内处死小鼠，对小鼠行气管插管，在左主支气管处结扎左肺，用1.5 ml生理盐水分3次灌洗右肺，回收液体量＞80%为合格，约1.0 ml/鼠，4℃，1 500 r/ min，离心10 min，收取各组细胞上清液，－80℃保存待测，取沉渣用血细胞计数板进行细胞计数，细胞分类计数。

1.4.3 BALF上清中细胞因子的检测IL-17的测定采用小鼠ELISA试剂盒，按说明书进行操作，根据光密度值(A)计算含量。

1.4.4肺组织病理切片切取小鼠左肺组织，多聚甲醛固定液中固定。常规取材、脱水、石蜡包埋、制备石蜡切片、HE染色。中性树胶封片，光学显微镜下观察组织形态、气道上皮损伤情况、气管及血管周围嗜酸性粒细胞浸润情况。

1.4.5免疫组织化学检测IL-17蛋白的表达水平

常规石蜡切片，脱水，吹干。PBS洗3次，每次5 min，3%H2O2室温孵育10 min，正常山羊血清室温封闭30 min，滴加兔抗IL-17抗体(1∶100)，4℃过夜，PBS洗3次，每次5 min，滴加生物素化羊抗兔IgG，室温孵育30 min，0.01 mol/L PBS清洗3次共5 min，DAB显色，常规脱水，透明，中性树胶封片。用PBS代替一抗做阴性对照，结果为阴性。光镜下肺组织中出现棕褐色产物为阳性反应。背景为蓝色。显微镜下随机选取5个视野，计算每个视野阳性细胞平均数。

1.4.6逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-17mRNA表达采用Trizol试剂提取右肺组织总RNA，逆转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)，以此为模板行PCR扩增。目的基因引物序列: IL-17(PCR产物为123 bp)上游引物: 5'-ACTACCTCAA CCGTTCCAC-3'，下游引物: 5'-GCTTTCCCTCC GCATT-3'，退火温度为56.9℃。β-actin上游引物: 5'-CATCCGTAAAGACCTCTAGCCAAC-3'。下游引物: 5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'，退火温度为56℃。比较IL-17与β-actin的相对吸光度值并进行半定量分析。

1.4.7流式细胞检测外周血Th17细胞摘除小鼠眼球取得外周血1 ml，肝素化处理，分离外周血单个核细胞，加入适当的佛波酯、离子霉素和莫能菌素液，置于50 ml/L CO237℃孵育箱培养5 h，加入抗小鼠mAb-anti-CD4－FITC 0.5 μl、anti-IL-17-PE 2.5 μl及其相匹配的同型对照，室温避光孵育30 min，经PBS液洗涤2次后，用0.1%的多聚甲醛500 μl重悬细胞，避光4℃保存24 h内上机，检测Th17细胞占外周血CD4细胞的比率。CellQuest软件分析Th17细胞和CD4细胞内IL-17的表达比率。

1.5统计学分析应用SPSS19.0统计软件，计量资料以x ±s表示，在方差齐性的基础上，行完全随机设计的多个样本均数比较采用χ2检验;组数两两比较采用LSD-t检验。用简单直线相关分析探讨两因素之间相关关系和程度。a = 0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组肺泡灌洗液白细胞及嗜酸性粒细胞的计数哮喘组中白细胞总数及嗜酸性粒细胞计数均高于其他三组，P＜0.05，差异有统计学意义，雷公藤甲素干预组及地塞米松干预组白细胞数及嗜酸性粒细胞数均较对照组高，P＜0.05。雷公藤甲素干预组与地塞米松干预组上述各指标间差异无显著性(P＞0.05)。见表1。

2.2 BALF中细胞因子IL-17、IL-23测定哮喘组IL-17、IL-23较对照组增高，P＜0.05，差异有统计学意义;雷公藤甲素干预组与地塞米松干预组较哮喘组低，较对照组偏高，P＜0.05，差异均有统计学意义。雷公藤甲素干预组及地塞米松干预组比较，P＞0.05，差异无统计意义。见表2。

表1　各组肺泡灌洗液白细胞与嗜酸性粒细胞数Tab．1 Numbers of total leukocyte and eosinophils in BALF

图1　各组小鼠肺组织病理切片(HE，×200)Fig．1 　Molphological changes in lung tissue among different group(HE，×200)

2.3肺部病理左肺组织病理可见:正常对照组小鼠肺组织细支气管和肺泡结构清晰，细支气管纤毛整齐，管腔完整，血管、肺泡腔、肺间质未见炎症细胞浸润，基底膜较薄，气管未见黏液痰栓(图1A) ;哮喘小鼠细支气管黏膜上皮脱落，气管柱状上皮及杯状细胞增生明显，气管周围见大量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润，部分小支气管见痰栓形成(图1B)。雷公藤甲素治疗组(图1C)及地塞米松干预组(图1D)气管周围及肺泡炎症细胞浸润较哮喘组减轻，气管柱状上皮细胞及杯状细胞增生亦较哮喘组减轻，但仍较正常对照组明显。

2.4肺组织中IL-17蛋白的表达各组小鼠肺组织切片免疫组织化学反应后均可见IL-17阳性反应的细胞，在显微镜下表现为棕黄色颗粒沉着: IL-17主要表达在支气管以及血管周围淋巴细胞等细胞胞核中(图2A～D)，与对照组(图2A)比较，哮喘组(图2B)阳性细胞数明显增多，表达增高(P＜0.05) ;雷公藤甲素(图2C)及地塞米松干预组(图2D)较哮喘组阳性细胞数有所下降，差异有统计学意义，P＜0.05)。见图2，表2。

2.5肺组织中IL-17 mRNA表达水平哮喘组IL-17 mRNA表达较对照组增高，P＜0.05，差异有统计学意义;雷公藤甲素干预组与地塞米松干预组较哮喘组低，但仍较对照组偏高，P＜0.05，差异有统计学意义。雷公藤甲素干预组及地塞米松干预组比较，P＞0.05，差异无统计意义。见表2。

2.6小鼠外周血Th17细胞占外周血CD4+T细胞的比率哮喘组外周血Th17细胞占外周血CD4+T细胞的比率较对照组增高，P＜0.05，差异有统计学意义;雷公藤甲素干预组与地塞米松干预组较对照组比较，P＜0.05，差异无统计学意义。雷公藤甲素干预组及地塞米松干预组比较，P＞0.05，差异无统计意义。见表2。流式图见图3。

Note: A.NC group; B.A group; C.TA group; D.DA group.

表2　各组IL-17、IL-17光密度值%、IL-17mRNA、Th17%及IL-23表达量比较Tab．2 Comparison of IL-17，IL-17AOD，IL-17 mRNA，Th17% and IL-23 expression among different group

表3　哮喘组中IL-23与WBC、EOS、血清IL-17、IL-17 mRNA、IL-17蛋白表达、Th17/CD4+T的相关分析Tab．3 Correlations between expression of IL-23 and total leukocyte numbers or eosinophil counts or IL-17 or IL-17mRNA or IL-17AOD or Th17/CD4+T in asthma group

3　讨论

现代医学理论认为，哮喘的本质是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种细胞及成分组成参与的气道慢性炎症。Th1/Th2失衡被认为是嗜酸细胞性哮喘主要的发病机制，而最近的研究表明，一种独立于Th1、Th2细胞的辅助性T淋巴细胞Th17细胞，它在哮喘中起了重要作用。Th17细胞亚群作为新发现的CD4+T细胞的一个分支［9］，分化成熟的Th17细胞可以分泌IL-17、IL-17F、IL-21、IL-22等多种细胞因子，其中IL-17是Th17分泌的最主要的效应细胞因子，Th17细胞主要是通过IL-17来发挥作用，Th17细胞可以募集、介导嗜酸性细胞和中性粒细胞的局部浸润和组织损伤［10］，而且实验证明，Th17淋巴细胞及相关细胞因子能加重哮喘小鼠气道炎症引发哮喘［11］。IL-23主要由树突状细胞、巨噬细胞分泌，尽管IL-23具有多种生物学作用，但其最重要的功能在于促进Th17细胞产生IL-17［3，9］。McGeachy通过研究IL-23R基因缺陷的小鼠发现，IL-23R缺陷的情况下，Th17细胞早期的活化受到抑制，Th17不能下调IL-2以及不能诱导IL-17的产生［12］。Li等［13］通过pSRZsi-IL-23p19沉默IL-23基因的研究显示，可抑制肺组织IL-23/IL-17的表达及减少血清IL-23/IL-17的含量。最近F.D.Finkelman等［14］的研究发现，C5a通过限制树突状细胞分泌的IL-23来实现对IL-17A的调控，抑制气道高反应性。以上表明IL-23/Th17(IL-17)炎症轴系在哮喘发生发展中起了重要作用。

雷公藤甲素(Triptolide TL，又叫雷公藤内酯醇)是从雷公藤中分离出来的二萜类化合物，具有抗炎和免疫调节作用。雷公藤甲素应用于临床治疗哮喘等疾病已有很多年历史，对哮喘的预防及控制显示出较好的作用，但其作用机制尚未十分清楚。Y.Wang及王敏等［5，6］体外细胞研究发现，雷公甲素可抑制Th17细胞的分化。最近Ying［15］研究表明，雷公藤甲素的免疫抑制功能主要是通过抑制Th17/ IL-17轴来实现，雷公藤甲素分离菌(Subglutinans)可有效阻止T细胞增殖和存活而深刻抑制分化完全的效应Th17细胞产生促炎性因子IL-17［16］。Th17在哮喘的发生、发展中起了重要作用，然而关于雷公藤制剂也是否能抑制哮喘患者或哮喘模型体内Th17细胞的分化以及其效应细胞因子IL-17，此类的研究目前尚未见报道。本研究发现，哮喘组BALF中炎症细胞浸润(白细胞、嗜酸性粒细胞)、BALF中IL-23、IL-17、肺组织IL-17 mRNA、IL-17蛋白表达、外周血Th17细胞的比例均较对照组增高，差异有显著性，而且呈正相关; IL-23与th17(IL-17)呈正相关，这结果跟此前的研究是一致的［2，13］。IL-23与BALF中的白细胞及嗜酸性粒细胞亦呈正相关，提示IL-23能促进嗜酸性粒细胞在气道的募集。可见IL-23/IL-17轴系在哮喘炎症的发生发展中起重要作用，与文献报道相一致［13，14］。在雷公甲素治疗组和地塞米松治疗组中，肺泡灌洗液中炎症细胞浸润(白细胞、嗜酸性粒细胞)较哮喘组明显减少，其BALF中IL-23、IL-17含量、肺组织IL-17 mRNA、IL-17蛋白表达、外周血Th17细胞的比例较哮喘组降低，且差异有显著性，提示雷公藤甲素通过下调IL-23表达抑制Th17细胞分化，进而减少IL-17的分泌，减轻哮喘气道炎症。IL-23/Th17(IL-17)炎症轴可能是雷公藤治疗哮喘的重要机制之一。

综上所述，本研究表明雷公藤甲素能减轻哮喘小鼠气道炎症，其作用机制可能是通过抑制IL-23/ Th17(IL-17)炎症轴实现，这可能是雷公藤甲素免疫抑制和抗炎作用的机制之一。相信通过本组实验的研究，将会为哮喘的防治提供一个新的尝试。

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［收稿2015-02-11修回2015-04-22］

(编辑张晓舟)

·生物治疗·

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．011

通讯作者及指导教师:成俊芬(1963年－)，女，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事呼吸疾病的基础和临床研究，E-mail: 137290639 39@ 139.com。

作者简介:杨志明(1981年－)，男，医师，主要从事哮喘基础与临床研究，E-mail: 108179658@ qq.com。

文章编号1000-484X(2015) 10-1347-06

文献标志码A

中图分类号R52.2+5