NF-κB P65 siRNA对IL-17诱导下MCP-1表达的影响作用

马　莉　沈　燕　(郑州大学第一附属医院检验科，郑州450052)



NF-κB P65 siRNA对IL-17诱导下MCP-1表达的影响作用

马莉沈燕(郑州大学第一附属医院检验科，郑州450052)

［摘要］目的:研究NF-κB P65 siRNA对IL-17诱导下心肌细胞MCP-1表达的影响作用。方法:差速贴壁法分离乳鼠心肌细胞进行原代培养。利用阳离子脂质体将NF-κB P65 siRNA瞬时转染入小鼠心肌细胞，荧光定量RT-PCR和酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测NF-κB P65 siRNA对IL-17诱导下MCP-1 mRNA和蛋白的含量变化。荧光定量RT-PCR和Western blot检测IL-17作用下P-P65和P65 mRNA和蛋白含量变化。结果:与转染阴性对照siRNA组相比，转染阴性对照siRNA+IL-17组MCP-1 mRNA和蛋白表达水平明显增加(P＜0.05)。与转染阴性对照siRNA组相比，转染NF-κB P65 siRNA组MCP-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。与转染阴性对照siRNA+IL-17组相比，转染NF-κB P65 siRNA+IL-17组MCP-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。NF-κB P65 siRNA转染24 h后，NF-κB P65在基因及蛋白水平表达均被明显抑制(P＜0.05)。IL-17作用心肌细胞不同时间后，检测发现随时间增加P-P65蛋白含量逐渐增加，15 min到达高峰，随后逐渐下降，各作用时间与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，而P65蛋白含量变化不大，各作用时间与空白对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。结论: IL-17可以通过促进心肌细胞内NF-κB P65磷酸化上调MCP-1的表达，而NF-κB P65 siRNA能够通过沉默P65基因表达有效抑制IL-17对MCP-1的上调作用。

［关键词］白介素17;单核细胞趋化蛋白1;病毒性心肌炎;核转录因子kappa B ;小干扰RNA

Role of NF-κB siRNA in MCP-1 levels induced by IL-17 stimulation in cardiac myocytes

MA Li，SHEN Yan.Department of Clinical Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

［Abstract］Objective: To investigate the effect of NF-κB p65siRNA of IL-17 inducing the expression of MCP-1 in the primary cultured cardiac myocytes.Methods: The cardiac myocytes were isolated from neonatal mice by different adhesion method.NF-κB P65 siRNA was transfected into cardiac myocytes and the rates of transcription and translation of MCP-1 were detected by RT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，the rates of transcription and translation of P-P65 and P65 were detected by RT-PCR and Western blot.Results: Compared with negative siRNA group，the expression of the MCP-1 at mRNA and protein levels were increased in negative siRNA +IL-17 group(P＜0.05) .Compared with negative siRNA group，the expression of the MCP-1 at mRNA and protein levels were decreased in NF-κB P65 siRNA group(P＜0.05) .Compared with negative siRNA+IL-17 group，the expression of the MCP-1 at mRNA and protein levels were decreased in NF-κB P65 siRNA+IL-17 group(P＜0.05) .The expression of the NF-κB P65 at mRNA and protein levels in cardiac myocytes were specifically and extensively suppressed by NF-κB P65 siRNA(P＜0.05) .After stimulated by IL-17，the amount of P-P65 in the cardiac myocytes was significantly increased in time-dependent manner compared with that of black group(P＜0.05)，but the levels of P65 changed little(P＞0.05) .Conclusion: IL-17 stimulates MCP-1 expression in cardiac myocytes via NF-κB activation，and NF-κB P65 siRNA can effectively inhibit the upregulation of IL-17 on MCP-1.

［Key words］IL-17 ; MCP-1; VMC; NF-κB ; Small interfering RNA

IL-17是一种重要的促炎细胞因子，可以通过与相应的受体(IL-17R)结合，激活靶细胞产生各种炎症细胞因子，从而介导炎症细胞到达局部引起组织损伤［1］。我们前期研究发现单核细胞趋化因子-1 (Monocyte chemoattractant protein1，MCP-1)在病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)心肌组织单个核细胞浸润中起重要作用［2，3］，并发现IL-17能够上调心肌细胞中MCP-1的表达［4］，但是IL-17通过哪种转录因子及信号通路上调心肌细胞中MCP-1的表达目前尚不清楚。NF-κB是调控炎症反应的关键核转录因子［5］，Chen等［6］研究发现IL-17可以激活巨噬细胞中NF-κB，Wang等［7］研究发现抑制大鼠系膜细胞中NF-κB的表达或激活可以抑制MCP-1的表达。但关于IL-17是否通过NF-κB上调心肌细胞中MCP-1表达尚未见文献报道。本研究通过利用RNA干扰技术特异性的抑制心肌细胞中NF-κB的表达，研究NF-κB siRNA对IL-17诱导心肌细胞中MCP-1表达的抑制作用，研究心肌细胞IL-17上调MCP-1中可能的转录因子，为病毒性心肌炎的防治提供一种新的生物治疗方法。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物1～3 d龄BALB/c乳鼠，SPF级实验动物，购于河南省实验动物中心。

1.1.2主要试剂胎牛血清、DMEM/F12培养基(Hyclone公司) ;胰酶、D-hank' s液、双抗溶液(Solarbio公司) ; 5-溴脱氧尿苷(Sigma公司) ;重组小鼠IL-17(Peprotech公司) ;小鼠MCP-1 ELISA检测试剂盒、核蛋白提取试剂盒、总蛋白提取试剂盒(武汉博士德公司) ; P65、P-P65和GAPDH抗体及二抗(Santa Cruz) ; Trizol试剂、PrimeScript逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司) ;荧光定量PCR试剂(北京康为世纪生物科技有限公司) ; siRNA-MateTM转染试剂(上海吉玛基因生物) ;细胞培养瓶、细胞培养板(耐思生物科技有限公司) ; DEPC水、PCR一次性耗材(上海生工公司) ; PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1心肌细胞的分离与培养无菌条件下取3 d以内BALB/c乳鼠心脏，放入预冷的D-Hank's液平皿中冲洗，剪成1 mm3左右碎片后冲洗并移入内置磁性搅拌子的50 ml三角瓶中，瓶内加入10 ml 0.08%胰蛋白酶37℃80 r/min搅动10 min。首次悬液弃去以后所得细胞悬液用等量含20%胎牛血清的培养基中止消化，200目筛网过滤后1 000 r/ min 10 min后重悬，接种于培养瓶，5%CO2，37℃培养90 min进行差速贴壁。收集含有未贴壁的心肌细胞培养液，细胞计数，将细胞密度调整为(2×104～3×104) ml－1后接种于24孔培养板，培养3 d即可用于实验。

1.2.2 siRNA序列的设计合成siRNA由锐博生物科技有限公司设计合成，包括目的基因NF-κBP65 siRNA:正义链5-GGAGUACCCUGAAGCUAUATT-3，反义链5-UAUAGCUUCAGGGUACUCCAT-3阴性对照siRNA:正义链5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，反义链5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3。

1.2.3 siRNA-MateTM转染siRNA于原代心肌细胞

取3 μl 1 mol/L的siRNA oligo溶液加入到100 μl无血清DMEM/F12，孵育5 min后，加入2 μl siRNAMateTM形成siRNA oligo-siRNA-Mate复合物。将复合物滴加到更换过培养基的24孔板内37℃，CO2培养箱孵育24～48 h。

1.2.4实时荧光定量RT-PCR检测心肌细胞MCP-1和P65 mRNA含量按Trizol说明书操作方法提取心肌细胞总RNA，Nano-Drop2000紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。按照PrimeScript逆转录试剂盒操作说明书进行操作，以Olig(dt)为引物将总RNA逆转录为cDNA，以逆转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件: 94℃预变性5 min，94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min。LightCycler 480检测并计算Ct值。扩增结束后，进行溶解曲线分析。采用相对定量的方法(2－△△Ct)来表示MCP-1 和P65的相对表达量。NF-κB-P65:上游引物5-TGATGTGCATCGGCAAGTG-3，下游引物5-AGAAGTTGAGTTTCGGGTAG-3; MCP-1:上游引物5-CGGAATTCGCCACCATGCAGGTCCCTGTCAT-3，下游引物5-GCTCTAGACTAGTTCACTGTCACACT-3; GAPDH:上游引物5-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3，下游引物5-GTCTGGGATGGAAATTGTGA-3。

1.2.5 ELISA检测心肌细胞培养上清中MCP-1蛋白含量收集细胞培养上清，2 000 r /min离心15 min，－80℃保存待测。根据小鼠MCP-1 ELISA检测试剂盒操作说明书将标准品进行系列稀释，绘制标准曲线。将待测标本室温平衡，经加样，温育，洗板，显色等步骤后终止反应。用酶标仪450nm处测定各孔A值，通过标准曲线计算出待测标本中MCP-1的浓度。

1.2.6 Western blot检测P-P65和P65蛋白含量收集各组细胞，按试剂盒说明提取总蛋白和核蛋白后进行蛋白定量(BCA法)。取各样品30 μg加入上样缓冲液，95℃变性5 min，10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜后，加相应二抗孵育2 h，TBST洗涤10 min×3次后ECL法发光，暗室曝光、显影、洗片，软件分析条带灰度值。

1.3统计学方法用SSPS13.0统计软件建立数据库，计量资料结果用x ±s表示，组间比较用单因素方差分析及LSD-t检验，检测结果P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 NF-κB P65 siRNA转染心肌细胞后对IL-17诱导下MCP-1表达的影响作用与空白对照组相比，转染阴性对照siRNA组MCP-1 mRNA和蛋白表达水平无明显差异(P＞0.05)。与转染阴性对照siRNA组相比，转染NF-κB P65 siRNA组MCP-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与转染阴性对照siRNA组相比，转染阴性对照siRNA+IL-17组MCP-1 mRNA和蛋白表达水平明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。与转染阴性对

表1　 ELISA检测心肌细胞MCP-1蛋白表达(x ±s，n=3)Tab．1 MCP-1 protein expression in cardiac myocytes detected by ELISA(x±s，n=3)

图1　逆转录荧光定量PCR检测心肌细胞MCP-1 mRNA表达Fig．1 MCP-1 mRNA expression in cardiac myocytes detected by FQ-RT-PCR

Note: 1.Blank group; 2.Negative siRNA group; 3.NF-κB P65 siRNA group; 4.Negative siRNA+IL-17 group; 5.NF-κB P65 siRNA+IL-17 group.Compared with Blank group，* .P＞0.05; compared with Negative siRNA group，#.P＜0.05; compared with NF-κB P65 siRNA group，Δ.P＜0.05.

图3　荧光定量RT-PCR检测心肌细胞P65 mRNA表达Fig．3 P65 mRNA expression in cardiac myocytes detected by FQ-RT-PCR

图4　 Western blot检测心肌细胞P65蛋白表达Fig．4 P65 protein expression in cardiac myocytes detected by Western blot

照siRNA+IL-17组相比，转染NF-κB P65 siRNA+IL-17组MCP-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表1、图1、2。

2.2 NF-κB P65 siRNA转染心肌细胞后对P65 mRNA和蛋白表达的影响作用与空白对照相比，转染阴性对照siRNA组P65 mRNA和蛋白表达水平无明显差异(P＞0.05)。与转染阴性对照siRNA组相比，转染NF-κB P65 siRNA组P65 mRNA和蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3、4。

2.3心肌细胞中IL-17作用不同时间对P-P65和P65蛋白含量变化的影响P-P65蛋白含量随时间增加而逐渐增加，15 min到达高峰，随后逐渐下降，各作用时间与空白对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。P65蛋白含量随时间增加变化不大，差异无统计学差异(P＞0.05)，见图5。

Note: Compared with controls，* .P＜0.05; compared with controls，#.P＞0.05.

3　讨论

VMC是病毒感染引起的弥漫性或局限性心肌炎性病变，由于其发病机制还不完全清楚，目前仍没有非常有效的治疗方式。通常认为在病毒感染初期，病毒可直接侵害心肌［8，9］，但严重的持久的心肌病变却是由心肌细胞自身免疫介导的［10，11］。目前，在抗炎治疗的研究中细胞因子受到普遍关注，但单纯的拮抗炎性细胞因子效果并不佳，因此对其炎症信号通路进行研究，寻找可能的转录因子作为干预靶点极为重要。NF-κB在调控炎症反应相关基因转录中起关键作用，是目前研究的热点。静息状态下NF-κB与IκB结合，以无活性状态存在于胞浆内。当细胞受细胞外信号刺激后，IκB激酶复合体(IκB kinase，IKK)活化将IκB磷酸化使NF-κB暴露核定位位点。游离的NF-κB磷酸化后进入细胞核，与特异性DNA序列结合，诱导相关基因转录，只有激活的NF-κB才能参与炎症的基因调控。Gui等［12］研究证实，抑制NF-κB信号可明显缓解CVB3诱导的心肌炎。但关于IL-17是否通过NF-κB上调心肌细胞中MCP-1表达尚未见文献报道。

为了研究NF-κB在IL-17上调MCP-1中的作用，我们将小鼠心肌细胞中NF-κB P65沉默处理后再予以IL-17诱导，发现MCP-1在基因及蛋白水平均受到明显抑制，说明IL-17对MCP-1的上调作用能够被NF-κB P65 siRNA所抑制。同时利用RTPCR和Western blot分别检测NF-κB P65 siRNA干扰作用下P65的变化情况及与对照组的差异，发现NF-κB P65 siRNA的导入使小鼠心肌细胞中NF-κB P65在基因及蛋白水平均受到明显抑制，表明NF-κB P65 siRNA可以有效沉默P65基因的表达。为了研究IL-17对心肌细胞中NF-κB的激活作用，我们将小鼠心肌细胞用IL-17作用不同时间后分别检测P65和P-P65蛋白含量变化，发现P-P65蛋白含量随时间增加而逐渐增加，15 min到达高峰，随后逐渐下降，而P65蛋白含量无明显改变，表明IL-17是通过促进P65磷酸化而不是通过诱导P65表达来上调MCP-1表达的。综上我们推测在VMC炎症反应中NF-κB的活化对于调节IL-17诱导下MCP-1对心肌细胞的炎症损伤起关键作用，NF-κB P65 siRNA能够有效地抑制MCP-1的表达从而减轻心肌细胞的损伤，为VMC免疫性损伤的治疗提供了新的思路。

有研究报道IL-17可以通过多条信号传导途径激活NF-κB［13，14］，我们推测ACT1/TRAF6/TAK1信号传导途径是IL-17上调MCP-1表达的最可能的信号传导通路，而具体实际情况尚需更深入的研究。总之，研究IL-17上调心肌细胞MCP-1表达的信号通路，可以为我们进一步揭示VMC的发病机制提供重要依据，为临床治疗提供新的思路。

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［收稿2015-04-02修回2015-05-14］

(编辑倪鹏)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．008

通讯作者及指导教师:沈燕(1966年－)，女，教授，硕士生导师，主要从事临床分子诊断与免疫学方面研究，E-mail: shenyan62687@ 163．com。

作者简介:马莉(1990年－)，女，主要从事临床分子诊断与免疫学方面研究，E-mail: 18446940@ qq．com。

文章编号1000-484X(2015) 10-1333-05

文献标志码A

中图分类号R392.11