瓦尼木层孔菌发酵液提取物对人结肠癌LoVo细胞增殖的影响*

张跃新，胡 伟**，邓 勋

（1.黑龙江省林副特产研究所，黑龙江 牡丹江 157011；2.黑龙江省森林保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150040）

瓦尼木层孔菌发酵液提取物对人结肠癌LoVo细胞增殖的影响*

张跃新1，胡 伟1**，邓 勋2

（1.黑龙江省林副特产研究所，黑龙江 牡丹江 157011；2.黑龙江省森林保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150040）

桑黄（Phellinusspp.）是一种珍贵的多年生大型药用真菌，具有独特的抗癌功效，是目前国际公认的生物治癌药剂中效率最高的一种药用真菌。该文从区域特种食（药）用真菌的开发利用角度出发，以采自黑龙江完达山的杨树桑黄即瓦尼木层孔菌（Phellinus vaninii）为研究对象，采用MTT方法比较了水提和酯提方法菌丝发酵液4个提取物对人结肠癌LoVo细胞增殖的抑制效果，计算高效提取物最佳作用浓度和IC50，绘制加药时间与抑制LoVo细胞增殖效果的曲线。研究结果表明，不同处理方法获得的提取物对人结肠癌LoVo细胞增殖的抑制效果差异显著，其中酯提效果好于水提，在1000 μg·mL-1浓度条件下，加药48 h后，正丁醇提取样品对人结肠癌LoVo细胞抑制率最高为86.8%，乙酸乙酯提取样品抑制率为87.5%，超声波提取样品对人结肠癌LoVo细胞抑制率为58.3%，直接水提效果最差，只有57.8%；桑黄菌丝体发酵液乙酸乙酯提取物IC50为53.459 μg·mL-1，在此浓度下，加药后96 h抑制率达到90%以上，加药120 h抑制率达95%，抑制率也随着加药时间的增加而提高。这为探求瓦尼木层孔菌资源价值的科学评价与有效开发奠定了基础，具有重要的学术和现实意义。

瓦尼木层孔菌；菌丝体发酵液粗提物；MTT法；LoVo细胞增殖；抑制作用

桑黄是一大类具有重要药用价值的大型真菌，目前所述桑黄均属木层孔菌属（Phellinusspp.），层孔菌属目前已发现251种左右，中国发现62种[1]。瓦尼木层孔菌（Phellinus vaninii）又称杨树桑黄，隶属担子菌纲 （Basidiomycetes） 非褶菌目 （Aphyllophorales）锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）木层孔菌属（Phellinus）[2]。最早在20世纪60年代被发现于俄罗斯的远东地区[3]，在我国主要分布在东北地区包括吉林省的长白山、黑龙江省的小兴安岭以及黑龙江省以东乌苏里江与兴凯湖之间的完达山、老爷岭等地区。主要生长在山杨活立木或倒木上，故称杨树桑黄[4-8]。与主要“桑黄”品种 [火木层孔菌（Phellinus igniarius）、裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）和鲍氏针层孔菌（Phellinus baumii）]具有相近分布区域、且质地外观比较相似的另外一种多年生兼性腐生菌。

“桑黄”是目前国际公认的生物治癌领域中有效率最高的一种药用真菌[9-12]，对多种癌细胞的生物测定均有显著抑制作用。其活性成分提取物具有显著的抗癌功效，Ikekawa等[13]发现，桑黄野生子实体的提取物对小白鼠肉瘤S180的抑制率为95.7%，通过提取桑黄的有效成分对癌细胞的直接杀灭效果接近100%的效果，从而使桑黄的抗癌作用引起关注。Sasaki等[14]发现桑黄中发挥抗癌作用的物质为多糖，目前，已从桑黄中分离出30多种单体化合物，分别属于黄酮类、香豆素类、甾醇类、萜类等。提取溶剂和方法的不同，会影响提取物的抗癌效果，Jong MH[15]采用浸提法比较了甲醇、氯仿、正丁醇和水对桑黄子实体的提取效率，结果表明，正丁醇提取率最好，其浸提物抗耐甲氧基西林金黄色葡萄球菌效果最好（MIC：63 μg·mL-1～125 μg·mL-1）。Ajith等[16]研究了桑黄乙酸乙酯、甲醇和水的提取物，然后分别用来抗Dalton淋巴腹水癌和Ehrlich腹水癌，发现水提物对它们没有细胞毒素作用，而这三个提取物对DLA引起的小鼠肿瘤细胞有显著的生长抑制作用，并且乙酸乙醋的提取物效果最好，在剂量为50mg·kg-1口服给药就可以和临床标准参考药顺铂4mg·kg-1的静脉注射效果相当。

杨树桑黄同样具有抑制肿瘤功效，并对脾胃虚弱、消化不良等也有良好的治疗作用，是一种极具开发价值的珍贵药用真菌[3]。笔者自90年末开始瓦尼木层孔菌资源环境调查与人工培育方面的研究[17]，分离得到多株杨树桑黄菌株，并且成功实现的人工栽培，获得子实体，为进一步优化栽培工艺，规模化生产奠定基础。在此基础上，本试验从区域特种食药用真菌的开发利用角度出发，以采自黑龙江完达山地区的瓦尼木层孔菌驯化菌株为研究对象，通过不同方法提取菌丝发酵液中的活性成分，采用MTT法研究其对人结肠癌LoVo细胞增殖的抑制效果，为探求区域性珍贵药用真菌瓦尼木层孔菌的科学评价与有效开发奠定基础。

1 试验材料和方法

1.1实验材料

人结肠癌LoVo细胞购自哈尔滨医科大学附属肿瘤研究所细胞库。

MTI（四甲基偶氮唑蓝）为SIGMA公司产品。DMEM细胞培养液、青霉素/链霉素（100 U）双抗溶液均为Hyclone公司产品。优级胎牛血清购自天津灏阳生物有限公司。胰蛋白酶为Amresco公司产品。其他试剂均为分析纯。

供试菌株为瓦尼木层孔菌（Phellinus vaninii）分离自黑龙江省完达山区，保存于东北林业大学森林微生物研究中心。

葡萄糖、琼脂、MgSO4·7H2O、KH2PO4、正丁醇、乙酸乙酯等均为分析纯试剂，购于化学试剂公司；RPMI 1640购于美国GIBCO公司；优质胎牛血清购于NQBB公司；DMSO、MTT购自索莱宝。胰酶由哈尔滨医科大学附属肿瘤研究所实验室提供。

1.2桑黄菌丝体发酵液提取物的制备

菌株发酵：将保存的菌种接种到PDA平板培养基上，置于26℃恒温培养箱中进行活化。用10 mm无菌打孔器切取活化好的菌株菌片，接种到装有300 mL PD培养基的三角瓶（500 mL） 内，每瓶接种6片，25℃、转速160 r·min-1摇床中培养15 d，得到菌丝体发酵液。

发酵液提取物的制备：对菌丝体发酵液采用水提和酯提2种方式。

水提样品的制备：采用直接提取法及超声波提取法2种方法。将菌丝体发酵液用8层无菌纱布过滤，得到直接水提样品；将菌丝体发酵液经超声波振荡提取50 min后，用无菌纱布过滤，取滤液，得到超声波提取样品，上述样品均经冷冻干燥机（-50℃）处理24 h，得到粉末状粗提物，4℃冷藏保存，使用前1000 r·min-1、4℃离心5 min，经Milles-HV Filter Unit除菌滤膜（直径0.22 μm）过滤除菌后进行抑制癌细胞生长测试。

酯提样品的制备：将菌丝体发酵液用无菌纱布过滤后，分别与正丁醇、乙酸乙酯按1/3（体积比）比例混合，常温下静止放置5 d后分液去掉下层水相滤液，将上层有机溶剂分别在60℃、40℃条件下，真空旋转蒸发除去溶剂后得到固体样品。

粗提物均用二甲基亚砜（DMSO）（终浓度＜1‰）助解，加RPMI 1640培养基稀释，配成2 000 μg·mL-1样品准备液，无菌条件下用Milles-HV Filter Unit除菌滤膜（直径0.22 μm）过滤除菌，4℃保存备用。

1.3细胞复苏培养

从液氮罐中取出冻存管37℃水浴1 min，无菌条件下从冻存管内吸出细胞悬液，放入离心管中，加4 mL RPMI 1640完全培养液，1000 r·min-1离心5 min，弃上清，加少许RPMI 1640完全培养液，吹打均匀后注入含有RPMI 1640完全培养液的细胞培养瓶，在5%CO2、37℃培养箱中培养，在癌细胞生长过程中，每一至两天对培养瓶中的培养液进行更换。待细胞密度生长至瓶壁80%时，倒去培养基，以0.25%胰蛋白酶消化瓶中细胞2 min～3 min，倒去胰蛋白酶溶液，加入少量RPMI 1640完全培养液，冲下壁上所有细胞，吸入离心管中，并加入8 mL PBS用吸管混匀，1000 r·min-1离心3 min弃上清。加入少量RPMI 1640完全培养液将细胞悬起以1∶2传代。

1.4MTT法检测瓦尼木层孔菌提取物对肿瘤细胞的细胞毒活性

主要测定不同提取方法和不同浓度瓦尼木层孔菌提取物对肿瘤细胞的细胞毒活性[18-19]。

取处于对数生长期的肿瘤细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，1000 r·min-1离心3 min。制备单细胞悬液，并调整浓度为3×104mL，以100 μL·孔-1接种于96孔培养板，置于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h。每孔加入不同药物10 μL，再加入新鲜RPMI 1640完全培养液90 μL，使其药物终浓度分别为103μg·mL-1、102μg·mL-1、10 μg·mL-1、1 μg·mL-1。平行设空白对照组（用等体积的RPMI 1640完全培养液代替受试药物），每组重复5个复孔。再培养48 h，每孔加入20 μLMTT继续培养4 h，弃去培养基，加入150 μLDMSO，震荡10 min。用酶标仪在490 nm波长检测OD值，根据OD值计算细胞抑制率CI（cytotoxic index，毒性指数，单位%）。抑制率正值表示对细胞有杀伤作用，负值表示对细胞有促增殖作用，比较不同处理方式的提取物对肿瘤细胞的抑制效果，同时初步确定有效的浓度范围。

CI=(1-OD1/OD0)×100%

式中：OD1表示试验组OD值；OD0表示对照组OD值。

在确定最佳提取方式和有效的浓度范围后，同样采用MTT法筛选提取物的最佳浓度，方法同上，处理中使其药物终浓度分别为100 μg·mL-1、80 μg·mL-1、60 μg·mL-1、40 μg·mL-1、20 μg·mL-1、10 μg·mL-1，测定对肿瘤细胞的细胞毒活性，筛选最佳浓度。

1.5最佳受试药物抑制LoVo细胞增殖与加药时间的关系

取处于对数生长期的肿瘤细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，1000 r·min-1离心3 min。制备单细胞悬液，将其浓度调整为3×104·mL-1，以100 μL·孔-1接种于96孔培养板，置于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h。加入瓦尼木层孔菌乙酸乙酯提取物药剂（IC50=53.459 μg·mL-1），再加入新鲜的RPMI 1640完全培养液90 μL。平行设空白对照组（用等体积的RPMI1640完全培养液代替受试药物），每个组5个复孔。通过上面的试验，确定最佳浓度以及提取方式。

分别培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后，每孔加入20 μL MTT继续培养4 h，弃去培养基，加入150 μLDMSO，震荡10 min。用酶标仪在490 nm波长检测光吸收值（OD），根据OD值计算细胞抑制率CI。根据抑制率与加药时间制作抑制曲线。

1.6数据处理

数据以均数±标准差（x±s） 表示，组间均数比较采用t检验，由SPSS17.0统计软件包进行统计学处理。

2 结果与分析

2.1不同方法瓦尼木层孔菌菌丝体发酵液提取物对肿瘤细胞的抑制作用

瓦尼木层孔菌菌丝体发酵液4种提取物作用LoVo细胞48 h的光吸收值（OD值）和抑制率（CI）见表1。

表1 瓦尼木层孔菌菌丝体发酵液不同提取物作用LoVo细胞48 h的OD值和抑制率（CI）Tab.1 OD value and the inhibition rate of different extracts of mycelium fermented broth of Phellinus vaninii for 48 h on tumor LoVo cells

由表1可见，4种方法制备的瓦尼木层孔菌菌丝体发酵液提取物对人结肠癌LoVo细胞的增殖均有一定抑制效果。其中正丁醇和乙酸乙酯的酯提物的抑制效果好于直接水提和超声波提取物。低浓度的提取物对LoVo细胞的抑制效果不明显，甚至有促进细胞增殖的作用。随着浓度的增高，对LoVo细胞的抑制率逐渐增加，在最佳浓度1000 μg·mL-1浓度条件下，加药48 h后，正丁醇提取样品对人结肠癌LoVo细胞抑制率最高为86.8%；乙酸乙酯提取样品抑制率为87.5%；超声波提取样品对人结肠癌LoVo细胞抑制率为58.3%；直接水提效果最差，只有57.8%。正丁醇和乙酸乙酯提取物虽然抑制效果相差不大，但是正丁醇在真空旋转蒸发时的温度为60℃，而乙酸乙酯只有45℃，综合考虑制备工艺和对LoVo细胞的抑制效果，选择乙酸乙酯提取液进行进一步的浓度筛选。

2.2瓦尼木层孔菌菌丝体发酵液乙酸乙酯提取物最佳作用浓度的筛选

设定在1 μg·mL-1～100 μg·mL-1浓度区间，测定不同浓度的乙酸乙酯提取物对LoVo细胞的抑制效果，见表2。

表2 瓦尼木层孔菌菌丝体发酵液乙酸乙酯提物不同浓度作用LoVo细胞48 h的OD值和抑制率（CI）Tab.2 Each group’s OD value and the inhibition rate of different concentration of mycelium fermented broth extract of Phellinus vaninii for 48 h on tumor LoVo cells

由表2可见，浓度为80 μg·mL-1和100 μg·mL-1的瓦尼木层孔菌菌丝体发酵液乙酸乙酯提取物加药48 h，对人结肠癌LoVo细胞的抑制率分别为79.9%和82.2%，与对照相比差异均极显著。通过回归分析，计算IC50值为53.459 μg·mL-1。

2.3最佳浓度和提取方式对肿瘤细胞抑制与时间的关系

瓦尼木层孔菌发酵液的乙酸乙酯提取物对人结肠癌LoVo细胞的抑制率与加药时间呈正比关系，随着加药时间的延长，其抑制效果越明显。药物作用96 h之前，加药时间与对细胞的抑制率呈一定的线性关系，在96 h时抑制率就达到了90%以上。加药120 h时，对癌细胞的抑制率几乎到达了100%，见图1。

3 结论与讨论

本文乙酸乙酯作为高效的提取溶剂的研究结果与Ajith等[19]用桑黄乙酸乙酯、甲醇和水的提取物，分别用来抗Dalton淋巴腹水癌和Ehrlich腹水癌，发现乙酸乙醋的提取物效果最好的结果相同。乙酸乙酯作为高效的提取溶剂在天然活性成分的提取中应用广泛。

图1 瓦尼木层孔菌乙酸乙酯提取物对肿瘤LoVo细胞抑制率及其时间关系Fig.1 Relationship between the inhibition effect and the administration time of ethyl acetate extract of mycelium fermented broth of Phellinus vaninii on tumor LoVo cells

本文采用不同处理方法获得的瓦尼木层孔菌菌丝体发酵液提取物对人结肠癌LoVo细胞增殖的抑制效果差异显著，其中酯提效果好于水提，在1000 μg·mL-1浓度条件下，加药48 h后，正丁醇提取样品对人结肠癌LoVo细胞抑制率最高为86.8%，乙酸乙酯提取样品抑制率为87.5%，超声波提取样品对人结肠癌LoVo细胞抑制率为58.3%，直接水提效果最差，只有57.8%。通过回归分析，瓦尼木层孔菌菌丝体发酵液乙酸乙酯提取物IC50为53.459 μg·mL-1，在此浓度下，加药后96 h抑制率达到90%以上，加药120 h抑制率达95%。抑制率也随着加药时间的增加而提高。

与桑黄相同，杨树桑黄的活性成分在抗癌研究中，作用明显。作为一类分布地域性很强的大型真菌，从区域特种食药用真菌的开发利用角度出发具有极大的开发和研究价值。本文为探求瓦尼木层孔菌资源价值的科学评价与有效开发奠定了基础，具有重要的学术和现实意义。深入研究杨树桑黄的活性成分的分离纯化工艺及其作用机理是今后亟待开展的工作。

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Effect of Mycelium Fermented Broth of Phellinus vaninii on the Proliferation of Colon Cancer LoVo Cells

ZHANG Yue-xin1,HU Wei1,DENG Xun2
(1.Heilongjiang Forest By-product and Speciality Institute,Mudanjiang 157011,China；2.Heilongjiang Forestry Protect Institute,Harbin 150040,China)

Phellinusspp.is a valuable,perennial and macro medicinal mushroom with a unique anticancer efficacy and is one of the most efficient and internationally recognized medicinal mushroom among the biological drugs in the cure of cancer.From the view of the development and utilization of regional special edible-medicinal mushroom,taking thePhellinus vaniniicollected from the region of Wanda Mountains in Heilongjiang province as the research object,the inhibition effect of 4 mycelium fermented broth extracts on the proliferation of colon cancer LoVo cells by water extract and ethyl acetate extract with the MTT assay was compared.The best concentration and IC50of efficient extract were calculated and the administration time and inhibition effect of proliferation of LoVo cells were determined.The results showed that the difference of the inhibiting effect of the extracts obtained by different methods on the proliferation of colon cancer LoVo cells was significant.Among them,the effect of ethyl acetate extract was better than water extract.At the concentration of 1000 μg·mL-1and 48 h after the medicine,the highest inhibition rate of butanol extract samples on colon cancer LoVo cells was 86.8%,which of ethyl acetate extract samples was87.5%,the inhibition rate of ultrasonic bath extract was 58.3%and the effect of direct water extract was the worst,only 57.8%. The IC50of the ethyl acetate extract of mycelium fermented broth of Phellinus vaninii was 53.459 μg·mL-1.At the concentration and 96 h after the medicine,the inhibition rate was more than 90%,120 h after the medicine,the inhibition rate was 95%and increases with the medicine time.It laid the foundation for seeking the scientific evaluation and the effective development of resources value of Phellinus vaninii and had an important academic value and realistic importance.

Phellinus vaninii;mycelium fermented broth extracts;MTT assay;inhibition effect of proliferation of LoVo cells

S646.9

A

1003-8310（2015）04-0062-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.04.015

黑龙江省财政厅自拟项目（2015-01）。

张跃新（1980-），男，硕士，助理研究员，主要从事食药用真菌资源开发研究。E-mail:robertn@163.com

*通信作者：胡伟（1964-），男，博士，研究员，主要从事大型真菌资源开发利用研究。E-mail:huwei64057@163.com

2015-04-30