培养皿培养对牛樟芝生长特性及其总三萜含量的影响*

冯路瑶，程显好**，李 寅，刘凤红，李维焕，刘 静

（1.鲁东大学菌物科学与技术研究院山东省食用菌技术重点实验室，山东 烟台 264025；2.烟台市中医院肿瘤科，山东 烟台 264000）

培养皿培养对牛樟芝生长特性及其总三萜含量的影响*

冯路瑶1，程显好1**，李 寅2，刘凤红1，李维焕1，刘 静1

（1.鲁东大学菌物科学与技术研究院山东省食用菌技术重点实验室，山东 烟台 264025；2.烟台市中医院肿瘤科，山东 烟台 264000）

为探讨牛樟芝（Antrodia camphorata）在固体培养基上的生长特性，采用固体琼脂培养基培养牛樟芝，观测不同培养基、不同碳源和不同氮源对牛樟芝生长、菌丝形态、菌丝中总三萜含量的影响。牛樟芝在6种不同培养基上的生长速度差别较大，菌丝形态也有差异。胡萝卜培养基、GPY培养基、PDA培养基和PDA加富培养基是比较适合于牛樟芝的固体培养基。在胡萝卜培养基、GPY培养基上培养的菌丝中总三萜含量较高。牛樟芝对所试不同碳源均可利用，在果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、木糖、木糖醇为碳源的培养基上生长较好，但在葡萄糖、麦芽糖、甘露糖为碳源的培养基上菌丝中三萜类成分含量更高。除了在以尿素为氮源的培养基上不生长之外，在其他所试氮源培养基上菌丝生长速度和菌丝形态有较大差别，在硫酸铵和鱼蛋白胨为氮源的培养上菌丝三萜类成分含量更高。

牛樟芝；固体培养；总三萜；碳源；氮源

牛樟芝（Antrodia camphorata）又名牛樟菇、樟窟内菇、红樟芝，隶属担子菌亚门（Basidiomycotina） 层菌纲（Hymenomycetes） 多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）薄孔菌属（Antrodia）。是一种原产于台湾的珍稀药用菌[1]。牛樟芝含有丰富的活性物质，主要的活性成分是三萜类化合物；具有多种生物活性，如保肝、调节免疫、抑制血管新生、抗肿瘤、抗炎症、抗氧化、降血压等[2]。

樟芝是台湾特有的菌种，牛樟树是其惟一的寄主。由于樟芝可造成牛樟树中心空洞腐朽，加上人们对牛樟树的乱砍乱伐，致使牛樟树资源相当稀少。近百年来，牛樟树难得一见，而能够长出牛樟芝的牛樟树则更少。因此樟芝十分珍贵，在台湾民间视若珍宝，被称为台湾森林中的红宝石[3]。

目前，牛樟芝的培养方式主要有液体培养和固体培养两大类。液体培养可以在较短时间内获得大量的菌丝体和发酵液，能极大地提高产量，弥补樟芝生长缓慢这个缺点，但是其活性产物的含量较低。而固体培养主要有椴木培养、菌包培养、培养皿培养等方法[4]。用牛樟树椴木培养可以得到质量较高的牛樟芝子实体，但因为其生长极其缓慢、生产周期较长，而且牛樟树为台湾一级保护树种，资源有限，这些都极大地限制了樟芝的产量[5]。

虽然目前已有牛樟芝固体培养的研究报道，但对于不同的常用真菌固体培养基上牛樟芝菌丝所含三萜类活性物质的含量尚未见报道。本实验主要通过皿培方式，研究了牛樟芝菌丝在不同的固体培养基上的生长特性，以及不同营养条件下牛樟芝菌丝的总三萜含量。

1 材料与方法

1.1材料

牛樟芝菌种，由山东省食用菌技术重点实验室保存于PDA培养基上。

1.2试剂

淀粉、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、木糖、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇、鱼蛋白胨、牛肉蛋白胨、酵母粉、酵母膏、硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硝酸钠、VB1、齐墩果酸、高氯酸、冰醋酸、甲醇、香草醛等。其中试剂类为国产分析纯或化学纯。

1.3培养基

麦芽汁培养基：每1升麦芽汁（手持糖量计测折光5.0）加入琼脂15g，pH自然。

PDA加富培养基：马铃薯200 g·L-1（煮汁）、KH2PO41 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、VB10.1 g·L-1、琼脂15 g·L-1，pH自然。

PDA培养基：马铃薯200 g·L-1（煮汁）、葡萄糖20 g·L-1、琼脂15 g·L-1，pH自然。

胡萝卜培养基：胡萝卜200 g·L-1（煮汁）、葡萄糖20 g·L-1、琼脂15 g·L-1，pH自然。

GPC培养基：葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、玉米浆10 g·L-1、琼脂15 g·L-1，pH自然。

GPY培养基：葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、酵母膏10 g·L-1、琼脂15 g·L-1，pH自然。

1.4培养方法

采用PDA加富培养基对保存的菌种进行活化，置于28℃恒温培养箱中培养15 d，备用。用直径8 mm的打孔器在长好的平板上均匀打孔，将每一小块牛樟芝菌种接种至不同培养基中央，于28℃暗培养，定期观察生长情况和菌落特征，测定菌落的扩散直径。

1.5牛樟芝利用碳源实验

在GPY培养基的基础上，分别用2%的以下碳源代替2%的葡萄糖[6]：淀粉、麦芽糖、蔗糖、果糖、甘露糖、木糖、乳糖、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇等，制成固体培养基平板。接种后28℃恒温暗培养，定期观察生长情况和菌落特征，测定菌落扩散直径。

1.6牛樟芝利用氮源实验

在GPY培养基基础上，分别用0.6%的以下氮源代替0.6%的蛋白胨：动物性氮源（鱼蛋白胨、牛肉蛋白胨），无机氮源采用0.2%的硝酸钠、硫酸铵。尿素试验采用0.2%的加量[6]。接种后于28℃恒温暗培养，定期观察生长情况和菌落特征，测定菌落扩散直径。

1.7不同碳源、氮源对牛樟芝菌丝干重的影响

在不同碳源、不同氮源培养基上接种牛樟芝菌种后，28℃暗培养50 d，菌丝体在培养基表面形成一层可剥离的密实菌丝层，测定菌丝的湿重，然后于60℃干燥至恒重，测定菌丝的干重。

1.8牛樟芝菌丝体中总三萜含量的测定

在不同培养基和不同碳源、不同氮源培养基上接种牛樟芝菌种后，28℃暗培养2个月，菌丝体在培养基表面形成一层可剥离的菌丝层，用不锈钢镊子仔细从培养基上将菌丝剥离下来，60℃干燥至恒重，测定总三萜的含量。

样品溶液：取菌丝粉样品0.5 g于50 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，超声波（40 kHz）提取2 h[7]，提取过程中经常摇动，3 200 r·min-1离心10 min，取上清液备用。

标准溶液：精确称取齐墩果酸10 mg，置于50 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，配置成浓度为0.2mg·mL-1的标准溶液[8]。

标准曲线的制作：准确取浓度为0.2mg·mL-1的齐墩果酸标准溶液0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL，分别放于具塞磨口试管中，然后用沸水浴加热挥发去溶剂。在每个试管中加入0.10 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，加塞。于60℃水浴恒温加热20 min，取出后立即用冰水冷却，分别加冰醋酸5 mL，摇匀，在550 nm处分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标，齐墩果酸质量为横坐标作图，得到标准曲线[8]。

样品溶液的测定：取样品溶液各0.3 mL，置于5个磨口试管中，沸水蒸干溶剂，按照制作标准曲线的方法测定吸光度值，计算牛樟芝菌丝中的总三萜含量。

2 结果与分析

2.1牛樟芝菌丝在不同培养基上的生长情况

6种培养基中，胡萝卜培养基、GPY培养基、PDA培养基和PDA加富培养基比较适合于牛樟芝的固体培养。牛樟芝菌丝的生长情况见图1和表1。

图1 在不同培养基上牛樟芝菌丝生长情况Fig.1 Growth condition of Antrodia camphorata cultured on different media

表1 在不同培养基中的牛樟芝菌丝生长情况Tab.1 Growth condition of Antrodia camphorata cultured on different media

从图1、表1可以看出，除麦芽汁培养基外，牛樟芝菌丝在PDA培养基、PDA加富培养基、胡萝卜培养基、GPY培养基、GPC培养基上的菌丝形态没有太大的差别，菌丝的生长速度也相对差不多，仅在不同培养时期菌丝的颜色变化上有所区别。牛樟芝菌丝在生长初期，接种块上的颜色有所不同：在GPY培养基、GPC培养基和麦芽汁培养基上接种块菌丝为白色，在胡萝卜培养基、PDA培养基和PDA加富培养基上接种块菌丝为粉色或橘红色。

2.2碳源对牛樟芝菌丝生长的影响

不同碳源对牛樟芝菌丝生长情况影响见表2。

从表2看出，牛樟芝菌丝对碳源的适应性很强，在不同碳源条件下都可以生长，不同碳源条件下其生长速度为：木糖醇＞木糖＞甘露糖＞葡萄糖＞麦芽糖＞果糖＞山梨醇＞甘露醇＞甘油＞乳糖＞蔗糖＞淀粉。

在所试碳源中，以果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、木糖、木糖醇作为碳源时，生长的菌丝较发达，菌丝相对较致密。在以葡萄糖、木糖、木糖醇、甘露糖为碳源时，牛樟芝菌丝老化较快，颜色变化也比较明显。以淀粉和蔗糖为碳源时，菌丝形态最为特殊，菌丝生长速度慢，而且菌丝呈白色，且比较稀疏。以淀粉为碳源时接种块为黑色。

2.3氮源对牛樟芝菌丝生长的影响

不同氮源条件下牛樟芝菌丝生长情况见表3。

表2 在不同碳源条件下牛樟芝菌丝生长情况Tab.2 Growth condition of Antrodia camphorata cultured on different carbon sources

表3 不同氮源条件下牛樟芝菌丝生长情况Tab.3 Growth condition of Antrodia camphorata cultured on different nitrogen sources

由表3可见，在不同有机氮源培养基上牛樟芝菌丝生长速度有较明显差异，但在以牛肉蛋白胨为氮源的培养基上，菌丝形态有较明显差异，菌丝浓密、较厚。在无机氮源条件下生长时，与硝酸钠、硫酸铵和尿素为氮源相比较，硝酸钠和硫酸铵都比较适合牛樟芝菌丝生长，但菌丝老化较快；以尿素为氮源未见到肉眼可辨的生长。

2.4不同碳源、氮源对牛樟芝菌丝干重的影响

不同碳源对菌丝干重的影响见表4和表5。

表4 不同碳源对牛樟芝菌丝干重的影响Tab.4 Effect of different carbon sources on mycelia dry weight of Antrodia camphorata

由表4、表5可见，不同碳源、氮源对牛樟芝菌丝干重无明显影响。牛樟芝菌丝在以葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖为碳源的培养基生长时，含水量较高。在以牛肉蛋白胨、鱼蛋白胨为氮源的培养基生长时，含水量也较高。由此得出，牛樟芝菌丝对甘油、木糖醇、甘露糖、山梨醇、硫酸铵、硝酸钠利用较好。

2.5牛樟芝菌丝体中总三萜含量

牛樟芝菌丝体中的三萜类成分有特征性紫外吸收峰，用紫外分光光度法测定不同培养基、不同碳源、氮源条件下牛樟芝菌丝中的总三萜含量，结果见表6～表8。

在不同培养基上，牛樟芝菌丝中总三萜含量有明显差异：在GPY培养基中总三萜含量最高；在GPC培养基和麦芽汁培养基中总三萜含量最低；在其他培养基中总三萜含量无明显差异；在麦芽汁培养基中，基本不含三萜类成分（表6）。

表5 不同氮源对牛樟芝菌丝干重的影响Tab.5 Effect of different nitrogen sources on mycelia dry weight of Antrodia camphorata

表6 不同培养基中牛樟芝菌丝体中总三萜含量Tab.6 Content of total triterpenes of Antrodia camphorata on different media

表7 不同碳源条件下牛樟芝菌丝体中总三萜含量Tab.7 Content of total triterpenes of Antrodia camphorata on different carbon sources

表8 不同氮源条件下牛樟芝菌丝体中总三萜含量Tab.8 Content of total triterpenes of Antrodia camphorata on different nitrogen sources

在不同碳源条件下，牛樟芝菌丝在以葡萄糖、麦芽糖、甘露糖为碳源的培养基中，总三萜含量较高，其他均无明显差异（表7）。

在不同氮源条件下，以鱼蛋白胨和硫酸铵为氮源的培养基中牛樟芝菌丝总三萜含量较高，以牛肉蛋白胨和硝酸钠为氮源的培养基中含量较低，以尿素为氮源的培养基中未见肉眼可见生长（表8）。

3 讨论

牛樟芝生长速度较慢，在不同的固体培养基上均能生长，菌丝形态有较大差异。三萜类物质作为牛樟芝的主要活性物质，在不同培养基中生长测得的含量有明显不同，可能与不同营养成分对三萜类物质合成所发挥的作用有关。

牛樟芝对碳源、氮源的利用较广泛[1]，对不同碳源和不同氮源均能利用，但生长速度差别大，表明牛樟芝对不同的碳源、氮源的利用有较明显的差异。菌丝形态在个别碳源、氮源条件下有较明显的不同。在以尿素为氮源的培养基上未见肉眼可辨生长，原因可能是樟芝菌缺乏尿素酶，不能有效利用尿素氮。使用无机氮为氮源时,菌丝必须利用无机氮合成自身所需要的氨基酸，而某些氨基酸几乎不能生物合成，从而影响樟芝菌丝的生长[2]。在不同碳源、氮源条件下，牛樟芝菌丝中总三萜含量的差异也较明显。

[1]宋爱荣.台湾樟芝对碳素营养源利用的研究[J].中国食用菌，2004，21（5）：41-43.

[2]Geng Yan,He Zhe,Lu Zhen-Ming,et al.Antrodia camphorata ATCC 200183 sporulates asexually in submerged culture[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2013,97(7):2851-2858.

[3]宋爱荣.樟芝对氮素营养源利用的研究[J].菌物研究，2004，2（1）：45-48.

[4]徐泰浩，林芳仪.台湾地区樟芝研究概况与发展趋势[J].食药用菌，2011，19（6）：24-29.

[5]姚秀英.牛樟芝人工培养条件的初步研究[D].济南：山东师范大学，2011.

[6]程显好，郭顺星.猪苓菌丝固体培养特性研究[J].中药材，2009，32（1）：11-14.

[7]王光磊，洪华炜，王宫.几种提取技术在樟芝总三萜提取中的应用和比较[J].海峡药学，2014，26（8）：31-33.

[8]王红梅，刘海燕，林淼，等.灵芝孢子粉中总三萜含量标准测定方法的改进[J].食用菌学报，2013，20（2）：42-45.

Cultural Characteristics and Content of Total Triterpenes of Antrodia camphorata on Solid Media

FENG Lu-yao1,CHENG Xian-hao1,LI Yan2,LIU Feng-hong1,LI Wei-huan1,LIU Jing1
(1.Institute of Mycological Science and Techology,Shandong Key Lab of Edible Mushroom Technology,Ludong University, Yantai 264025,China;2.Yantai City Hospital Oncology Department,Yantai 264000,China)

To explore the cultural characteristics of Antrodia camphorata on solid media,A.camphorata was cultured on solid agar medium.Effects of different media,carbon sources,and nitrogen sources on growth and morphology of A.camphorata were observed,and the effects to the content of total triterpenes of A.camphorate were explored.The growth velocity and morphology of A.camphorata were different in various media.Carrot media,GPY media,PDA media and PDA enrichment media were suitable for solid culture.The content of total triterpenes of A.camphorata on carrot media and GPY media were higher than in other media.Different carbon sources could be utilized by A.camphorate.A.camphorata grew better when fructose,maltose, mannose,xylose,xylitol as carbon sources in submerged culture conditions.The content of total triterpenes of A.camphorata was higher when glucose,maltose,mannose as carbon sources.Better adaptability to nitrogen source except for urea were observed in A.camphorate.A.camphorata has not grown when urea as nitrogen source.The growth velocity and morphology of A.camphorata were different in various nitrogen sources.The content of total triterpenes of A.camphorata was higher taking ammonium sulphate and fish peptone as nitrogen sources.

Antrodia camphorata;solid-state culture;total triterpenes;carbon source;nitrogen source

S646.9

A

1003-8310（2015）04-0031-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.04.007

山东省现代农业产业技术体系食用菌产业创新团队资助项目（SDAIT-11-011-11）。

冯路瑶（1989-），女，在读硕士研究生，研究方向为菌物生态学。E-mail:fengluyaojy@sohu.com

**通信作者：程显好（1966-），男，博士，教授，主要从事菌物生态学和食（药）用真菌产品研发工作。E-mail:chengxianhao@sohu.com

2015-05-19