铀和重金属复合污染对菊苣叶绿素荧光特性的影响

李华丽，唐永金，b*，曾 峰

(西南科技大学a.生命科学与工程学院，b.核废物与环境安全国防重点学科实验室，中国绵阳 621010)

随着核燃料与核工业技术的发展，核素在开采和利用过程中对环境造成的污染问题日益引起人们的关注.铀是目前最主要的核原料，在自然条件下存在3 种同位素:234U，235U 和238U［1-3］.铀既是一种核素，同时也是一种重金属，其毒性效应源于它的化学性质和放射性质，毒性的大小与铀化合物的溶解性密切相关，溶解度越高，毒性越大［4］.铀的溶解态通常以铀酰离子(［UO2］2+)的形式存在.环境中的铀污染主要来自于反应堆、核武器的研究试验、核燃料产品、铀矿山“三废”排放、事故性核泄漏等［5］.铀矿往往伴生有铁矿物、钙镁矿物、硅酸盐、铝硅酸盐及锰化合物等，因此，在铀污染的地区其他重金属的含量也很高，如Fe，Mn，Mg，Ca，Cu 和Zn 等［6］.被污染环境中的重金属可以通过食物链等多种途径进入人体，对人类带来很大的危害，因此，开展铀和其他重金属的生物效应及其污染环境的生物修复方面的研究具有非常重要的意义.

目前，富集植物的筛选仍然是国内外有关铀和重金属污染生物修复研究的重要内容，已经发现美洲商陆(Phytolacca americana L.)可以富集Mn［7］;羽叶鬼针草(Bidens maximowicziana Oett)可以富集Pb［8］，并且对Pb 的耐受性强;凤眼莲(Eichhornia crassipes)对Cd2+，Pb2+有很高的去除率［9］;向日葵(Helianthus annuus)和菊苣(Cichorium intybus L.)对铀污染土壤具有潜在的修复能力［10-11］;苎麻(Boehmeria nivea)对土壤Hg 有一定的吸收能力［12］;蜈蚣草(Pteris vittata L.)是一种As 的超积累植物［13］.此外，铀和其他重金属对植物种子萌发、抗氧化酶体系、光合作用的影响也有一些报道［14-16］，但目前关于铀和其他重金属复合污染对植物光合作用的影响研究却鲜有报道，大多集中于单一元素污染的影响.本实验以菊苣(Cichorium intybus L.)为实验材料，采用叶绿素荧光技术，研究铀与Cd2+，Pb2+，Hg2+和Ni2+复合污染对菊苣叶片光系统活性的影响，为铀和重金属复合污染影响植物生长的生理机制提供一定的理论依据.

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试植物为菊苣(Cichorium intybus L.)，种子由武汉庆发禾盛种业有限责任公司生产.唐永金等(2013)对14 种植物研究发现，在500 μg·g－1铀污染的土壤中菊苣对铀的富集量最高，达到728.7 μg·g－1DW［10］.

供试土壤为壤土，土壤中铀和5 种重金属的本底值分别为铀2.26 μg·g－1，镉4.449 μg·g－1，铅48.83 μg·g－1，汞0.117 μg·g－1，镍103.79 μg·g－1，铬149.27 μg·g－1.

供试药剂为:UO2(CH3COO)2·2H2O，Cd(CH3COO)2·2H2O，Pb(CH3COO)2·3H2O，Ni(CH3COO)2·4H2O，(CH3COO)2Hg，Cr(CH3COO)3·6H2O，其中铀的同位素为238U.

1.2 试验方法

盆栽试验，每盆2 kg 干土.铀处理量分别为0，50，100，150 μg·g－1干土，每个铀处理量下设计5 个重金属处理，各重金属的处理分为0、低含量、高含量.低含量大约为土壤背景值的1 倍(汞除外)，高含量大约为土壤背景值的5 倍(表1).以铀和重金属的0 处理作为对照.3 次重复.试验在西南科技大学核素生物效应试验场通风透光的塑料避雨棚中进行.

表1 重金属处理设置(单位:μg·g －1)Tab.1 Concentration of heavy metals used in this test(unit:μg·g －1)

按照土壤最大持水量法［15］，先将铀和重金属配制成母液，根据各处理组合混合在一起，然后用自来水定容至720 mL(预备试验确定的土壤最大持水量)浇入土壤中，保证试验土壤被药液均匀污染.土壤药剂处理在2012年12月28日进行，在阴凉干燥处放置两个月以上，使土壤吸附固定，代表污染土壤［17］.2013年3月18日播种，出苗后2 周每盆定苗9 株.每1～2 天浇一次水，保持土壤湿度在田间持水量的60%～70%.5月21日开始测定叶绿素荧光.

1.3 测定方法

叶绿素荧光参数的测定采用便携式脉冲调制叶绿素荧光仪(PAM-2500，Walz).测定前暗适应30 min，每盆测定植株上部最长最大的叶片.

(1)荧光诱导曲线参数的测定 打开测量光测定初始荧光(F0)，再执行一个饱和脉冲光测定最大荧光(Fm)，然后打开光化光(光强为300 μmol·m－2·s－1)持续5 min，并隔20 s 执行一次饱和脉冲.PSⅡ的最大光合量子产量(Fv/Fm)、PSⅡ的实际光合量子产量(Yield，即Y(Ⅱ))、通过PSⅡ的电子传递速率(ETR)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(qN)等荧光参数通过PAM-WIN 软件(Walz)获得.

(2)光响应曲线参数的测定 光响应曲线参数的测定参考White(1999)［18］和陈梅(2013)［19］的方法.光合有效辐射(PAR)梯度设定为0，5，24，110，222，413，713，1 287，1 842，2 593 和3 768 μmol·m－2·s－1，每个光强持续时间为20 s.测定完光诱导曲线后，将荧光仪调到光响应曲线测定模式，获得表观量子效率(α)、最大电子传递速率(ETRmax)和半饱和光强(Ik)等参数.

1.4 数据处理

测得的数据用DPS 9.5 进行方差分析和Duncan 新复极差法多重比较.因Cr 处理的土壤中植物大部分死亡，故不在此进行分析.

2 结果与分析

2.1 铀和重金属复合污染对菊苣F0，Fm 和Fv/Fm 的影响

F0，Fm和Fv/Fm是植物叶片叶绿素荧光特性的重要参数.F0可以反映逆境胁迫对植物叶片PSⅡ永久性伤害的程度，Fm反映了通过PSⅡ的最大电子传递潜力，Fv/Fm可以反映出完整植物叶片的光合器官的生理状况.

由表2 可知，在铀单独作用下，随铀含量的增加，F0逐渐升高，Fv/Fm则有一定程度的下降，当铀为150 μg·g－1时，F0比0 处理增加了18.98%(P ＜0.05)，Fv/Fm比CK(铀和重金属均为0 处理)降低了6.05%(P＜0.05).在重金属单独作用下(铀处理为0 μg·g－1)，F0随Cd2+和Ni2+处理量的增大而升高，随Pb2+和Hg2+处理量的增加而降低，但是均高于对照值0.374;当Cd2+为25 μg·g－1时比对照增加了21.66%，增加显著(P ＜0.05).Fm随着金属含量增加而减小，并且低含量处理下均大于对照值1.960，高含量处理中除Pb2+处理外都小于对照.Fv/Fm随着Cd2+含量升高而显著降低(P ＜0.05)，随Pb2+含量升高而略有增加.

在铀和4 种重金属分别共存的条件下，w(238U)≤100 μg·g－1时，F0值高于单独的铀处理，并且在同一铀含量下，随着Cd2+含量增加而增加，当Cd2+为25 μg·g－1时达到最大值，显著(P ＜0.05)高于单独的铀处理(w(238U)=50 μg·g－1.)，增加了21.87%.在同一铀含量处理下，Cd2+含量增加时，Fm和Fv/Fm减小，当w(Cd2+)=25 μg·g－1时小于单独的铀处理，当w(Pb2+)=50 μg·g－1及w(Ni2+)=100 μg·g－1时Fm大于单独的铀处理，Fv/Fm变化较小.当w(238U)=150 μg·g－1时，各重金属使F0均低于单独的铀处理，当w(Cd2+)=25 μg·g－1和w(Hg2+)=5 μg·g－1时F0分别比单独的铀处理降低了14.38%和13.9%，相反的，Fv/Fm均高于单独的铀处理.

Fv/Fm是评价植物遭受胁迫的最重要指标.在低铀含量下，镉、铅、汞离子的存在，降低了植物的Fv/Fm值，增加了植物的胁迫，但镍离子的存在几乎不产生影响;在高铀含量下，重金属离子的存在，提高了Fv/Fm值，降低了铀离子单独的胁迫.

表2 铀和重金属复合污染下菊苣叶片F0、Fm、及Fv/Fm 的变化(平均值±标准差，n=3)Tab.2 Changes in the minimal fluorescence yield(F0)，the maximum fluorescence yield(Fm)，and Fv/Fm of the leaves of Cichorium intybus L.exposed to multiple contamination of uranium and heavy metals.Values are means ± SD(standard deviation)of three measurements

2.2 铀和重金属复合污染对菊苣Yield，ETR，qP 和qN 的影响

PSⅡ的实际光合量子产量(Yield)反映了PSⅡ反应中心有部分关闭情况下的原初光能捕获效率.由表3可知，在铀单独作用下，Yield 值随铀浓度增加先升高后降低，当w(238U)=50 μg·g－1时比0 处理升高了5.73%.在重金属单独作用下，Pb2+，Hg2+及Cd2+低含量使Yield 值高于对照值0.593，Ni2+没有影响.铀和重金属共存时，在同一铀含量处理下，Yield 值随Cd2+，Pb2+和Ni2+含量的升高而降低，在Cd2+，Pb2+的高含量及Ni2+处理下小于单独铀处理.

PSⅡ的电子传递速率(ETR)反映PSⅡ反应中心在光适应条件下的实际电子传递情况.光化学淬灭系数(qP)表明植物吸收的光能用于光化学反应部分的大小，qP增加反映PSⅡ的电子传递活性升高.由表3 可知，在不同的处理组合中(高含量Cd2+除外)ETR 和qP均大于CK，说明向土壤中添加铀和重金属离子有助于菊苣叶片PSⅡ反应中心的电子传递.在铀和重金属单独作用下，随着铀和重金属含量的升高，ETR 和qP表现出增加的趋势.当w(238U)≥100 μg·g－1时，铀和高含量的Cd2+，Pb2+及Hg2+，Ni2+共存的条件下，ETR 值小于单独铀处理，但是高于单独的重金属处理，qP小于单独的铀及重金属处理.

非光化学淬灭系数(qN)反映PSⅡ天线色素吸收的部分光能没有用于光合电子传递而以热形式耗散掉了，是植物的一种自我保护机制，能对光合机构起到一定的保护作用.从表3 中的数据可见，在单独的铀作用下，当w(238U)=100 μg·g－1时qN达到最大值，比CK 增加了20.86%，当w(238U)=150 μg·g－1时则比0 处理降低了11.14%.在重金属单独作用下，qN随Cd2+含量增加而增加;随Pb2+和Ni2+含量的增加而略有降低，但仍然高于0 处理.铀和Cd2+，Ni2+共存时，qN随铀和Cd2+，Ni2+含量的增加而升高，当w(238U)=150 μg·g－1和w(Cd2+)=25 μg·g－1，w(Ni2+)=500 μg·g－1时达到最大值，分别比对照增加了45.02%和81.67%(P ＜0.01).在铀和Pb2+共存的处理中，当w(238U)=50 μg·g－1时qN随Pb2+含量增加而降低，当w(238U)≥100 μg·g－1时则表现出相反的变化趋势;含Hg2+的处理与Pb2+处理的变化趋势相反.

表3 铀和重金属复合污染下菊苣叶片Yield、ETR、qP 及qN 参数的变化(平均值±标准差，n=3)Tab.3 Changes in the actual photochemical efficiency of PSII(Yield)，the photosynthetic electron transport(ETR)，the photochemical quenching coefficient(qP)and the non-photochemical quenching coefficient(qN)of the leaves of Cichorium intybus L.exposed to multiple contamination of uranium and heavy metals.Values are means ± SD(standard deviation)of three measurements

实验结果表明，同一铀含量处理下，重金属离子的存在提高了植物叶片的qN，植物的自我保护机制增强;同时高含量重金属离子的存在降低了Yield、ETR 和qP，植物天线色素的捕光功能下降，电子传递链受阻.

2.3 铀和重金属复合污染对菊苣叶片快速光响应曲线参数的影响

表观量子效率(α)表示光响应曲线的初始斜率，反映了叶片对光能，尤其是对弱光的利用效率.最大电子传递速率(rETRmax)是不存在光抑制时的最大光合速率，即潜在的最大相对电子传递速率，代表叶片光合作用的最大能力.半饱和光强(Ik)可以反映叶片对强光的耐受能力.在铀单独作用下，α，rETRmax和Ik变化均不显著，呈现出先上升后下降的趋势.α 在w(238U)≥100 μg·g－1时小于CK;rETRmax和Ik在w(238U)=100 μg·g－1时达到最大值，与CK 相比分别增加了14.76%和21.90%.在重金属单独作用下，α，rETRmax和Ik的变化不显著.与CK 相比，Pb2+和Hg2+的存在提高了3 个指标;在高含量Cd2+作用下，α 和rETRmax小于对照，Ik大于对照;在高含量Ni2+作用下，α 增加了3.32%，rETRmax和Ik有所降低.

铀和重金属共存的处理中，当w(238U)≥100 μg·g－1时，向土壤中添加重金属离子后，α 大于单独的铀处理，增幅大于1%;其中，w(238U)=150 μg·g－1，w(Cd2+)=25 μg·g－1增加了16.28%(P ＜0.05)时，增加显著.rETRmax和Ik的变化一致，在加入高含量的重金属后，这两个指标都低于单独的铀处理.在同一铀含量处理下，Hg2+浓度的变化对rETRmax和Ik的影响不大，随着Cd2+，Pb2+和Ni2+浓度的增加，rETRmax和Ik逐渐减小.rETRmax和Ik都在w238U=150 μg·g－1，w(Ni2+)=500 μg·g－1时达到最低值，比单独的铀处理减少27.51%和34.95%，比对照减少24.39%和28.73%，变化不显著.

单独的铀污染对α 的影响表现为低浓度促进，高浓度抑制，对rETRmax和Ik表现为促进作用.复合污染情况下，高含量铀与重金属离子共存提高了α，降低了rETRmax和Ik，增加了植物叶片对光能的利用效率，降低了植物的潜在最大电子传递速率和对强光的耐受能力.

3 讨论

光合作用是植物生长的重要生理过程，叶绿素荧光与光合作用的各个反应过程都有紧密的关系，能够反映内外环境条件的变化对光合系统Ⅱ(PSⅡ)的影响［20］.正常环境中高等植物的Fv/Fm在0.832 ± 0.004范围内，当植物受到胁迫时Fv/Fm会显著下降，因此该指标被广泛用于研究各种逆境环境对植物生长的影响，其降低的幅度可以反映逆境对植物光合作用的伤害程度［21-22］.Fv/Fm的下降是由F0升高及Fm降低引起的.本实验的结果表明，土壤中高浓度的铀引起菊苣叶片F0显著升高，Fv/Fm显著下降，Fm有所降低，但是不显著，说明高浓度铀污染土壤对菊苣的光合生理有毒害作用;同时，Cd2+，Pb2+，Hg2+，Ni2+4 种重金属对这3 个指标也有类似的影响，其中Cd2+的毒害较为严重.当土壤中有多重元素同时存在时，适当浓度的不同元素之间会发生交互作用，加强或者减弱单一元素对植物的影响.冯韶辉等(2013)等的研究结果显示，Cd 与较高质量浓度的Cu(1.0 mg·L－1)联合胁迫使热带海草泰来藻的光保护机制丧失，而Cd 与较低质量浓度的Cu(0.1 mg·L－1)联合却可以激发泰来藻的光保护机制［23］.本实验也表明，Cd2+，Pb2+，Hg2+和Ni2+都可以在一定程度上缓解高含量铀对菊苣的伤害，主要表现为当w(238U)=150 μg·g－1时，含有重金属的处理与单独的铀处理相比F0下降，Fv/Fm和Fm升高.

在单一铀元素处理中，菊苣的ETR 和qP大于0 处理，Yield 和qN在低含量时大于0 处理，含量升高后则降低;低含量的Cd2+使Yield 和ETR 升高，高含量Cd2+却使其降低，qP和qN则随着Cd2+含量的升高而增加;而Pb2+，Hg2+和Ni2+处理使得这4 个参数均有所增加.这说明向土壤中添加适当浓度的铀和重金属有助于菊苣叶片的PSⅡ对原初光能的捕获效率和电子传递;低含量的铀和重金属胁迫下，菊苣可以通过热耗散的方式使光合机构免于或减轻伤害，而过高含量的铀和重金属胁迫，如w(238U)=150 μg·g－1和w(Ni2+)=500 μg·g－1，则会严重伤害这种光保护机制，使其丧失功能.铀与重金属共存时，qN升高，Yield、ETR 和qP降低，说明适量重金属离子的存在可以减轻铀对光保护机制的伤害程度，甚至使其有所增强，却不利于菊苣叶片PSⅡ的原初光能捕获效率和电子传递.另外，w(238U)≥100 μg·g－1时，单独的铀作用下，α 降低，rETRmax和Ik略有升高;向土壤中添加重金属后α 升高，rETRmax和Ik降低，说明Cd2+，Pb2+，Hg2+和Ni2+可以缓解高浓度铀对菊苣叶片的光能利用能力的伤害，却减弱了铀对菊苣叶片的电子传递速率和对强光的耐受能力的促进作用，甚至带来负面影响.

与单一胁迫相比，联合胁迫对植物生长的影响复杂得多［24-25］，仅用一个指标来判断铀和重金属复合污染对植物生长的影响程度是不够的，只有同时结合多种指标才能更好地判断植物的生长状况.一般认为，重金属的复合作用改变了金属的生物有效性或毒性，危害更大［26-27］.王天弘(2013)研究了铅镉复合污染对互花米草光合作用的影响，结果显示铅镉相互作用使叶绿素的含量明显降低［28］.有研究表明Pb 对土壤中Cd的有效性起激活的作用，而Zn 却对土壤中Cd 的有效性起抑制作用［29］，说明不同的重金属之间复合对植物造成的影响不同.本文研究结果认为，土壤中适量的重金属可以减轻铀对菊苣毒性作用，可能是因为重金属改变了铀的生物效应.

4 结论

联合胁迫对植物生长的影响比较复杂.本研究表明:铀与Cd2+，Pb2+，Hg2+和Ni2+复合污染对植物叶绿素荧光参数的变化有一定的影响.(1)在低铀浓度下，Cd2+，Pb2+和Hg2+的存在降低了植物的Fv/Fm值，增加了对植物的胁迫，但Ni2+的存在几乎没有影响;在高铀浓度下，重金属离子的存在提高了Fv/Fm值，减轻了铀离子单独胁迫对植物的伤害;(2)高浓度的铀和重金属复合污染下qN升高，Yield、ETR 和qP降低，植物的自我光保护能力增强，天线色素的捕光功能下降，电子传递链受到影响;(3)高浓度铀与重金属复合污染使植物叶片的α 值升高，rETRmax和Ik下降，植物对光能，尤其是弱光的利用能力增强，潜在的最大电子传递速率和对强光的耐受能力降低.

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