宫颈癌组织中miRNA-34c的表达水平分析及其靶基因PLK4的鉴定

张红红 刘晓丽 许思娟

·基础研究·

宫颈癌组织中miRNA-34c的表达水平分析及其靶基因PLK4的鉴定

张红红 刘晓丽 许思娟

目的：分析miRNA-34c在宫颈癌组织中的表达水平并鉴定其新的靶基因。方法：利用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测甘肃省妇幼保健医院34例宫颈癌和癌旁正常组织中miRNA-34c表达水平。利用miRNA靶基因预测数据库预测miRNA-34c新的靶基因Polo样激酶4（PLK4）。将含有PLK4的3‘UTR片段荧光素酶载体分别与miRNA-34c模拟物或阴性对照共转染HEK293T细胞，并检测其荧光素酶活性。在人宫颈癌细胞SiHa细胞中分别转染miRNA-34c模拟物或阴性对照，利用qRT-PCR法和Western blot法分别检测靶基因的mRNA和蛋白质的表达水平。结果：与癌旁正常组织相比，miRNA-34c在宫颈癌组织中表达下调。在HEK293T细胞中，miRNA-34c模拟物显著抑制荧光素酶的活性（P<0.01）。miRNA-34c模拟物显著下调SiHa细胞中PLK4的mRNA和蛋白质的表达（P<0.01）。结论：miRNA-34c在人宫颈癌组织中表达下调，且能与PLK4的3’UTR结合并下调其mRNA和蛋白质的表达。

miRNA-34cPLK4宫颈癌

宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，其死亡率居女性恶性肿瘤的首位，其发病率呈升高和低龄化趋势［1-2］。microRNA（miRNA）是一种长度约为22个核苷酸的非编码单链小RNA，通常与靶基因mRNA完全或不完全匹配结合，诱导靶mRNA降解或阻遏其转录后翻译［3-4］。miRNA-34家族包括miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c，在抑制癌症发生中起到很重要的作用［5］。在miRNA-34家族中，目前对miRNA-34a的研究较多，而对miRNA-34b和miRNA-34c的研究较少。miR-34c有miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p两个成熟形式，在多种癌细胞中异常表达，包括宫颈癌细胞［6］。已证实miRNA-34c能够作用于靶基因E2F3、MYCN、Bcl-2和c-Met抑制癌细胞增殖，锚定非依赖生长和诱导细胞凋亡［7-8］，但其许多功能尚未知。本研究将对miRNA-34c在宫颈癌组织的表达水平进行分析，并鉴定其新的靶基因Polo样激酶4（PLK4），为宫颈癌的治疗提供新的靶点和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样本 样本取自甘肃省妇幼保健医院2011年3月至2013年10月收治的34例宫颈癌患者的肿瘤组织及癌旁正常组织（癌旁正常组织距离肿瘤边缘>5 cm），冻存于液氮中。病理类型为鳞癌19例、腺癌12例、其他3例。

1.1.2 试剂及仪器 Trizol试剂和脂质体2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；RNA反转录试剂盒和荧光实时定量聚合酶链式反应（real time-quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自日本Takara公司；DMEM培养基购自美国Hyclone公司，FBS-500胎牛血清购自美国Gibco公司；寡核苷酸miRNA-34c模拟物和阴性对照购自广州复能公司；pmirGLO Vector和双荧光素酶报告基因检测系统购自美国Promega公司；PLK4和GAPDH一抗，山羊抗小鼠IgG购自美国Sigma公司；人胚肾细胞株HEK293T，人宫颈癌细胞株SiHa为本科室保存；荧光定量PCR仪Mx3000P购自美国Agilent公司；Power⁃Pac基础电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胚肾细胞HEK293T和人宫颈癌细胞SiHa使用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下培养。

1.2.2 荧光实时定量PCR 50 mg宫颈癌组织或癌旁正常组织从液氮取出后加入1 mL Trizol试剂匀浆，按照操作说明提取总RNA，分装于-70℃冻存。按照RNA反转录试剂盒说明书操作，逆转录条件为30℃、10 min，42℃、30 min，85℃、5 min。合成的cDNA作为模版进行qRT-PCR扩增，反应体系为cDNA 1 μL、上下游引物各0.6 μL（表1）、SYBR Green荧光染料Mix 10 μL、无菌蒸馏水7.6 μL及ROX 0.4 μL。反应条件为94℃预变性2 min，95℃变性5 s，60℃退火延伸20 s，循环40次，72℃延时5 min。miRNA-34c及PLK4 mRNA的相对表达量通过2-ΔΔCT法计算，ΔΔCT=（待检样品基因平均CT-待检样品管家基因平均CT）-（对照组基因平均CT-对照组管家基因CT），分别以U6及GAPDH作为内参。

1.2.3 miRNA-34c靶基因预测 为了预测miRNA-34c的作用靶基因，使用TargetScan、miRBase和miRDB 3个数据库均出现的靶基因为miRNA-34c目标靶基因。

1.2.4 mRNA-34c靶基因荧光素酶报告基因载体构建 在NCBI网站下载靶基因PLK4的3'UTR序列，设计PCR引物。PCR扩增得到的目的片段连接到pM⁃DTM-T载体，行双酶切回收目的片段并插入到荧光素酶报告基因载体pmirGLO Vector上，命名为pmir⁃GLO-PLK4。

1.2.5 荧光素酶活性检测 将HEK293T细胞接种于96孔板，将50 pmol/L miRNA-34c模拟物（序列AG⁃GCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC）或阴性对照与构建的80 ng pmirGLO-PLK4质粒共转染HEK293T细胞。转染48 h后，采用双荧光素酶报告基因检测系统溶液裂解细胞，检测荧光强度。

1.2.6 Western blot分析 将SiHa细胞接种于6孔板，miRNA-34c模拟物和阴性对照分别转染SiHa细胞。48 h后，采用RIPA法提取总蛋白，取30 μg蛋白经10%SDS-PAGE胶分离后，半干转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，分别用抗PLK4小鼠单克隆抗体（1:1 000稀释），抗GAPDH小鼠单克隆抗体（1:5 000稀释）孵育过夜，再与山羊抗小鼠IgG孵育1 h，曝光显色。

1.2.7 MTT法检测细胞的增殖 SiHa细胞转染miR⁃NA-34c模拟物和阴性对照48 h后加入0.5 mg/mL MTT，孵育4 h，并收集细胞，加100 uL DMSO，室温振荡10 min。使用酶联仪在570 nm波长处测定各孔光吸收值（OD），绘制细胞增殖曲线。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS18.0软件进行统计学分析。荧光素酶计数和miRNA-34c模拟物抑制PLK4 mRNA和蛋白计量的统计表达均采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

2 结果

2.1 miRNA-34c在宫颈癌组织和癌旁正常组织的表达采用qRT-PCR法检测miRNA-34c在34例宫颈癌及癌旁正常组织中的表达，以U6作为对照。结果显示，与癌旁正常组织相比，宫颈癌患者组织中miR⁃NA-34c表达水平明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01，图1）。

图1 miRNA-34c在宫颈癌及癌旁正常组织中的相对表达Figure 1 Relative expression of miRNA-34c in cervical cancer tissues and normal paraneoplastic tissues

2.2 miRNA-34c靶基因的预测

为进一步探讨miRNA-34c在宫颈癌中的作用，本研究采用生物信息学软件TargetScan、miRBase和miRDB预测miRNA-34c可能的靶基因，选取3个数据库均预测得到的靶基因作为候选，结果发现与肿瘤密切相关的PLK4为miRNA-34c预测的靶基因。图2中竖线连接部分显示miRNA-34c的种子序列靶向PLK4的3'UTR区。

2.3 荧光素酶活性检测

为验证miRNA-34c是否能与PLK4的3'UTR区直接结合，将构建好的pmirGLO-PLK4载体分别与miRNA阴性对照和miRNA-34c模拟物共转染到HEK293T细胞，48 h后收集并裂解细胞，检测其荧光素酶活性。结果显示，与miRNA阴性对照相比，转染miRNA-34c模拟物的荧光素酶的活性明显降低（P< 0.01，图3），提示PLK4是miRNA-34c的靶基因。

图2 miRNA-34c种子序列与靶基因PLK4的3'UTR结合位点Figure 2 Binding sites of miRNA-34c to PLK4 3'UTR

图3 miRNA-34c模拟物抑制荧光素酶活性Figure 3 miRNA-34c mimics repress luciferase activity

2.4 SiHa细胞增殖检测及PLK4的mRNA和蛋白表达

MTT法检测显示，转染miRNA-34c模拟物后，Si⁃Ha细胞增殖能力明显低于转染miRNA阴性对照（P< 0.01，图4A）。qRT-PCR结果显示，与阴性对照相比，转染miRNA-34c模拟物细胞中的PLK4 mRNA表达水平显著降低（P<0.01，图4B）。转染miRNA-34c模拟物细胞中的PLK4蛋白表达也明显低于阴性对照（图4C、D）。以上结果表明在SiHa细胞中miRNA-34c可能通过下调PLK4表达来影响细胞增殖。

图4 SiHa细胞中PLK4 mRNA和蛋白表达Figure 4 Relative mRNA and protein expression levels of PLK4 in SiHa cells

3 讨论

miRNA通过与靶基因mRNA的3'UTR结合，诱导靶基因mRNA降解或阻遏其转录后翻译，从而在转录后水平调控基因的表达，miRNA通过作用于多个靶基因调控不同的生物学过程，如细胞发育、分化、增殖、凋亡［9］。某些特异性miRNA可作为肿瘤标志物，有利于肿瘤的临床诊断、治疗及预后分析。研究发现宫颈癌组织及细胞株中许多miRNA异常表达［10］，但相关致病机制目前仍不清楚。

miRNA-34c在多种肿瘤中表达下调，Liu等［11］证实miRNA-34c在非小细胞肺癌中表达下调，miRNA-34c通过靶向调节eIF4E表达抑制小细胞肺癌的细胞生长。Hagman等［5］发现抑制miRNA-34c表达能促进前列腺癌细胞的生长，而过表达miRNA-34c前列腺癌细胞中其侵袭能力明显减弱。最近，Re等［12］证实miRNA-34c在喉鳞状细胞癌组织中低表达，增加患者肿瘤的复发风险。同样，本研究证实了miRNA-34c在宫颈癌组织中的表达下调，通过生物信息学预测了其新的靶基因PLK4；通过荧光素酶活性检测证实了miRNA-34c可直接与靶基因PLK4的3'UTR区结合；转染miRNA-34c模拟物能显著下调SiHa细胞中PLK4 mRNA和蛋白质的表达，影响细胞增殖。因此，本研究证实了PLK4是miRNA-34c的靶基因，为宫颈癌的发生或发展机制研究提供了新的线索。

PLK4是一种广泛存在于哺乳动物、高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，属于Polo-like激酶家族的成员［13］。PLK4在正常的非分裂期细胞中几乎不表达，而在正常的处于分裂期的细胞中，PLK4的表达显著升高。由于肿瘤细胞是一类增殖/分裂处于失控状态的细胞，因此PLK4在人类多种肿瘤细胞中呈过表达，包括胃癌、结直肠癌、乳腺癌等［14］。研究显示，PLK4过表达使中心粒过度复制，引起细胞的异常分裂，促进肿瘤发生及发展［15］。这些研究表明PLK4是一个非常有潜力的肿瘤治疗靶标。miRBase数据库显示miRNA-34c可调节数百个靶基因，而每个靶基因可能发挥不同的生物学功能，本研究仅选择了与宫颈癌发生相关的基因PLK4作为miRNA-34c的候选靶基因，将为阐明miRNA-34c在宫颈癌发生中的作用机制提供有力的证据。

综上所述，本研究明确了miRNA-34c与宫颈癌的相关性，鉴定了PLK4为miRNA-34c的靶基因，为进一步研究宫颈癌发生或发展机制提供了新的线索。

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（2015-09-17收稿）

（2015-11-10修回）

Analysis of miRNA-34c expression in cervical cancer tissue and preliminary identification of Polo-like kinase 4 as its target gene

Honghong ZHANG,Xiaoli LIU,Sijuan XU

Department of Obstetrics and Gynecology,Intensive Care Unit,Gansu Provincial Maternity and Child Health Hospital,Lanzhou 730050,China

Objective:To analyze the expression profile of miRNA-34c in cervical cancer tissue and identify its novel target gene. Methods:The expression levels of miRNA-34c were detected in 34 paired cervical cancer tissues and normal paraneoplastic tissues via quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR).Polo-like kinase 4(PLK4)is a target gene of miRNA-34c predicted in the miRNA Target Database.Luciferase vector containing the binding site of miRNA-34c to PLK4 3'UTR and miRNA-34c mimic or negative control were co-transfected into HEK293T cells,and luciferase expression was examined.The miRNA-34c mimic or negative control was transfected into SiHa cells,and the mRNA or protein expression of PLK4 was detected via qRT-PCR or Western blot,respectively.Results:MiRNA-34c expression was lower in cervical cancer tissues than in normal paraneoplastic tissues.The miRNA-34c mimics significantly inhibited luciferase activation in the HEK293T cells(P<0.01)and significantly decreased the mRNA and protein expression levels of PLK4 in the SiHa cells(P<0.01).Conclusion:MiRNA-34c is significantly decreased in cervical cancer tissues.Moreover,miRNA-34c can significantly repress the mRNAand protein expression levels of PLK4 by directly targeting the 3'UTR.

miRNA-34c,PLK4,cervical cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.22.028

甘肃省妇幼保健医院妇产科重症救护中心（兰州市730050）

张红红 zhhzyzhh@sina.cn

张红红 专业方向为妇科肿瘤研究与诊治。

E-mail：zhhzyzhh@sina.cn