CtBP2在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义*

管程齐 肖明兵 陆翠华 倪温慨 江枫 倪润洲

·临床研究与应用·

CtBP2在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义*

管程齐 肖明兵 陆翠华 倪温慨 江枫 倪润洲

目的：研究羧基末端结合蛋白2（C-terminal binding protein 2，CtBP2）在食管鳞状细胞癌组织中的表达情况及其与食管癌发生发展的关系。方法：Western blot法检测8对食管鳞状细胞癌新鲜冰冻组织、免疫组化法检测90例食管鳞状细胞癌石蜡切片组织中CtBP2表达情况，结合临床病理和随访资料分析CtBP2表达与患者临床病理参数及总生存率的关系。结果：两法检测结果均显示CtBP2食管鳞状细胞癌组织中的表达明显高于对应的癌旁组织，且CtBP2的表达水平与食管癌的组织学分级（P= 0.002）、浸润深度（P=0.032）相关，而与年龄、性别等参数无相关性。Kaplan-Meier分析结果显示，CtBP2高表达组患者的总体生存率明显低于CtBP2低表达组患者。结论：CtBP2在食管鳞状细胞癌组织中表达显著上调，提示其可能与食管鳞状细胞癌的发生发展相关。

食管鳞状细胞癌 CtBP2 转录因子 免疫组化

食管鳞状细胞癌（以下简称食管癌）是全球发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，其5年生存率小于30%。其发生与亚硝胺的慢性刺激、饮水、粮食蔬菜中微量元素的含量、炎症与创伤以及遗传因素有关［1］。转录因子因其存在的广泛性和调控的多样性，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、浸润转移以及血管生成等各环节密切相关［2］。羧基末端结合蛋白（C-terminal bind⁃ing protein，CtBP）是进化上保守的转录抑制因子，是DNA结合蛋白与转录抑制酶之间的桥梁，能与一些DNA或蛋白质特异性结合，从而抑制基因的转录［3］。CtBP2是蛋白家族中的一员，作为短距离的转录抑制物的功能被研究得最多，然而，其作用的具体机制至今不清楚［4］。目前国内外对于CtBP2与食管癌的相关性研究较少。本研究旨在检测CtBP2在食管癌组织中的表达，探讨其表达水平与患者的临床病理参数及预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

90例食管癌患者的石蜡组织标本，收集自2000年1月至2004年12月就诊于南通大学附属医院胸外科实施手术的患者，其中男性63例，女性27例，年龄31～80岁，平均年龄61岁。所有患者术前均未行化疗或放疗，均有完整的临床病理资料。8例配对的新鲜食管癌及癌旁组织标本于手术取材后立即置于-70℃冰箱内保存，用于后续实验。本研究通过南通大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 Western blot实验 用蛋白裂解液提取组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度，将制备好的蛋白加入2× SDS上样缓冲液，沸水浴15 min蛋白变性，取等量待测蛋白样品及蛋白marker上样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转至PVDF膜，将转印膜浸入含5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭2 h，分别将稀释后的CtBP2（1:200）、β-actin（1:50）的一抗浸润转印膜，4℃孵育过夜，TBST洗膜后浸润于HRP标记的二抗中室温孵育2 h，再次洗膜后使用ECL方法进行显影，曝光，胶片晾干后，扫描并分析其灰度。将目的蛋白与内参灰度进行对比，所得的比值即为目的蛋白的相对表达量。

1.2.2 免疫组化染色 所有石蜡组织标本常规烤片、脱蜡、水化，加入柠檬酸钠缓冲液抗原修复，用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，4%脱脂牛奶封闭30 min，1:100稀释的CtBP2鼠抗人单克隆抗体（美国BD公司）室温孵育2 h，用PBS洗涤，滴加HRP标记的山羊抗鼠IgG（美国Sigma公司）室温孵育30 min，PBS充分洗涤后使用DAB显色，流水冲洗后用苏木素复染，酒精、二甲苯脱水，最后封片镜检。未加一抗者为阴性对照。

1.2.3 CtBP2阳性判定标准 因CtBP2系细胞核表达，故免疫组化阳性信号以细胞核内出现棕黄色染色为阳性细胞。在光学显微镜200倍的视野下，对每张切片具有代表性的肿瘤区域随机选择5个视野，染色结果采用半定量积分法判断，即根据染色强度及阳性细胞分布比例进行评分。染色强度评分定义为：0（阴性）、1分（弱阳性）、2分（阳性）、3分（强阳性）。阳性细胞百分比评分定义为：1（<10%）、2（11～50%）、3（51～80%）、4（>80%）。以染色强度得分×阳性细胞百分比得分为最终染色评分，0～4分为低表达，>4分为高表达［5］。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0统计分析软件对实验数据进行分析。CtBP2在食管癌中的表达和相应临床病理学特征之间的关系采用χ2检验、Fisher精确概率法分析。用Kaplan-Meier法描绘患者生存曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CtBP2在人食管鳞状细胞癌及癌旁组织中的表达Western blot结果显示：CtBP2在食管鳞状细胞癌中的表达明显高于对应癌旁食管组织。食管癌组织中均可检测到CtBP2的表达，对应的癌旁组织中低表达或缺失表达，增殖指标PCNA作为阳性对照（图1）。

图1 CtBP2蛋白在食管鳞状细胞癌及配对癌旁组织中的表达Figure 1 CtBP2 expression in human ESCC and paired adjacent normal tissues

2.2 CtBP2在人食管鳞状细胞癌及癌旁石蜡切片组织中的表达

免疫组化结果表明：癌旁组织中低表达或缺失表达（图2A）。CtBP2在食管癌中高表达，主要表达定位于细胞核，染色呈棕黄或棕褐色（图2B）。

图2 CtBP2在食管鳞状细胞癌及癌旁组织中的表达（S-P×200）Figure 2 Immunohistochemical analysis of CtBP2 expression in human ESCC and paired adjacent normal tissues(S-P×200)

2.3 CtBP2的表达与食管鳞状细胞癌临床病理因素的相关性

将统计数据分为高表达组和低表达组。通过两组的对比结果分析显示CtBP2的表达强度与食管癌患者的肿瘤组织学分级（P=0.002）、浸润深度（P= 0.032）相关，而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、有无淋巴结转移、临床分期无相关性（表1）。

表1 食管鳞状细胞癌中CtBP2表达水平与临床病理参数的关系Table 1 CtBP2 expression and clinicopathological parameters in 90 ES⁃CC specimens

2.4 CtBP2在食管鳞状细胞癌中总体生存率的评价

将CtBP2按高、低表达分组，使用Kaplan-Meier法分析患者总体生存情况。CtBP2高表达的患者5年生存率显著降低（图3）。

图3 CtBP2的表达与患者总体生存率的关系Figure 3 Association between GtBP2 expression and patient survival

3 讨论

现今对于食管癌患者主要采用手术治疗辅以放疗、化疗等综合治疗手段，但其临床治疗效果及远期预后仍不理想，复发率及病死率较高［1］。目前对食管癌分子机制的研究表明其发生发展与多种癌基因过度表达以及肿瘤抑制基因的失活密切相关，是涉及多种致癌基因改变的复杂病理过程，这些基因通过各种信号转导通路调节细胞增殖、细胞周期控制、细胞凋亡［6］。而转录水平的调控是基因发挥功能的一个重要过程。针对转录因子的活化与抑制，可以从不同环节寻找药物作用靶点，从而来预防与转录因子调控相关的肿瘤疾病［2］。在研究与E1A C末端结合并下调癌基因转录的细胞蛋白时，人们发现了Ct⁃BP家族，CtBP蛋白家族是脊椎动物和非脊椎动物正常发育过程中必不可少的，并且该家族是进化中保持了高度保守性的转录抑制因子，它们和DNA结合的转录因子协作来调节靶基因的表达而参与细胞生物学行为，在细胞核内作为转录辅抑制因子起作用，而在细胞质内则控制膜转运［7］。作为转录辅阻遏物，在转录调控过程中，CtBP能够与多种识别并结合特异性DNA序列的转录因子形成转录复合物，募集各种染色体修饰酶，最终抑制与胚胎发育、细胞分化和分裂、肿瘤发生相关的基因转录［3］。早期研究发现在原代成纤维细胞中CtBP可通过抑制肿瘤抑制因子转录而调控细胞的衰老和再生，证实CtBP既是肿瘤抑制因子p16INK4A［8］、E-cadherin以及PTEN［9］的负性调节子，又是肿瘤抑制因子INK4A/Arf［10］、APC［11］、HIPK2［12］导致细胞凋亡的下调靶点。近年来越来越多的研究表明CtBP家族在各种肿瘤发生、发展中起到重要作用，如乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌等［13］。

由于差异性RNA剪接、翻译后修饰，CtBP家族存在多个亚型，且各个亚型以时间和空间上的差异化模式进行表达，表现出各亚型存在功能特异性。CtBP1-L和CtBP2具有辅抑制因子活性，而CtBP1-S可能参与高尔基体膜分裂，RIBEYE可能具有在中枢神经系统中形成突触的功能［3］。其中CtBP2是家族重要成员之一，定位在染色体21q21.3上，它有一个高度保守的功能区域，其N端的20个氨基酸对于其定位和活性非常重要，可特异性识别并结合含PX⁃DLS（-Pro-X-ASP-Leu-Ser-，X常是亮氨酸或缬氨酸）序列的相互作用蛋白。其C端形成一个具有与NAD+和NADH结合位点的单独结构域，可使两CtBP单体相互作用形成均聚物或异源多聚物［9］。CtBP2在胚胎发育、脂肪形成、血管生成方面均发挥重要作用［3］，而近年来很多研究发现CtBP2与肿瘤关系密切［10］。研究表明在结肠癌中CtBP2与TCF-4相互作用激活其转录活性引起下游靶基因β-catenin的激活导致细胞的迁移［15］。在乳腺癌中CtBP2通过调节E-candi⁃herin的转录促进肿瘤细胞迁移［16］。在肺癌细胞中过表达CtBP2引起靶基因PTEN去磷酸化，促使细胞增殖能力增强［17］。在前列腺癌中CtBP2通过激活c-Myc信号通路促进细胞增殖［18］。在本研究中采用免疫组化方法发现CtBP2在食管鳞状细胞癌中显著高表达，并且主要定位于细胞核中，8对新鲜食管癌及癌旁组织的蛋白质电泳结果也显示CtBP2在癌组织中的表达显著高于癌旁组织。对CtBP2临床病理因素分析表明其与组织学分级及浸润深度差异有统计学意义。Kaplan-Meier分析结果显示，CtBP2高表达组患者的总体生存率显著下降。以上结果提示CtBP2高表达与食管癌的恶性分化程度密切相关，作为独立预后因子可能参与了食管癌的发生发展过程。

综上所述，本研究发现CtBP2蛋白的表达水平与肿瘤组织学分级、浸润深度、患者总体生存率显著相关，是食管鳞状细胞癌的分子标记物之一，也提示CtBP2可能是潜在肿瘤基因治疗一个新的靶点，然而，CtBP2导致食管癌变过程的具体生物学机制还需进一步研究。

[1] Pennathur A,Gibson MK,Jobe BA,et al.Oesophageal carcinoma [J].Lancet,2013,381(9864):400-412.

[2] Wong MM,Guo C,Zhang J.Nuclear receptor corepressor com⁃plexes in cancer:mechanism,function and regulation[J].Am J Clin Exp Urol,2014,2(3):169-187.

[3] Stankiewicz TR,Gray JJ,Winter AN,et al.C-terminal binding proteins:central players in development and disease[J].Biomol Concepts,2014,5(6):489-511.

[4] Zhao LJ,Subramanian T,Vijayalingam S,et al.CtBP2 proteome: Role of CtBP in E2F7-mediated repression and cell proliferation [J].Genes Cancer,2014,5(1-2):31-40.

[5] Liu LK,Jiang XY,Zhou XX,et al.Upregulation of vimentin and aberrant expression of E-cadherin/beta-catenin complex in oral squamous cell carcinomas:correlation with the clinicopathologi⁃cal features and patient outcome[J].Mod Pathol,2010,23(2):213-224.

[6] Rustgi AK,El-Serag HB.Esophageal carcinoma[J].N Engl J Med,2014,371(26):2499-509.

[7] Cohen MJ,Yousef AF,Massimi P,et al.Dissection of the C-terminal region of E1Aredefines the roles of CtBP and other cellular targets in oncogenic transformation[J].J Virol,2013,87(18):10348-10355.

[8] Mroz Edmund A,Baird Abigail H,Michaud William A,et al. COOH-terminal binding protein regulates expression of the p 16 INK 4 A tumor suppressor and senescence in primary human cells [J].Cancer research,2008,68(15):6049-6053

[9] Paliwal S,Ho N,Parker D,et al.CtBP2 Promotes Human Can⁃cer Cell Migration by Transcriptional Activation of Tiam1[J]. Genes Cancer,2012,3(7-8):481-490.

[10]Chen YW,Paliwal S,Draheim K,et al.p19Arf inhibits the inva⁃sion of hepatocellular carcinoma cells by binding to C-terminal binding protein[J].Cancer Res,2008,68(2):476-482.

[11]Schneikert J,Brauburger K,Behrens J.APC mutations in colorec⁃tal tumours from FAP patients are selected for CtBP-mediated oligomerization of truncated APC[J].Hum Mol Genet,2011,20 (18):3554-3564.

[12]Hofmann TG,Glas C,Bitomsky N.HIPK2:A tumour suppressor that controls DNA damage-induced cell fate and cytokinesis[J]. Bioessays,2013,35(1):55-64.

[13]Straza MW,Paliwal S,Kovi RC,et al.Therapeutic targeting of C-terminal binding protein in human cancer[J].Cell Cycle,2010,9 (18):3740-3750.

[14]Chinnadurai G.The transcriptional corepressor CtBP:a foe of multiple tumor suppressors[J].Cancer research,2009,69(3):731-734.

[15]Patel J,Baranwal S,Love IM,et al.Inhibition of C-terminal bind⁃ing protein attenuates transcription factor 4 signaling to selective⁃ly target colon cancer stem cells[J].Cell cycle,2014,13(22):3506-3518.

[16]Paliwal S,Ho N,Parker D,et al.CtBP2 Promotes Human Cancer CellMigration by TranscriptionalActivation ofTiam1[J]. Genes&cancer,2012,3(7-8):481-490.

[17]Paliwal S,Kovi RC,Nath B,et al.The alternative reading frame tumor suppressor antagonizes hypoxia-induced cancer cell migra⁃tion via interaction with the COOH-terminal binding protein co⁃repressor[J].Cancer research,2007,67(19):9322-9329.

[18]Zhang C,Gao C,Xu Y,et al.CtBP2 could promote prostate can⁃cer cell proliferation through c-Myc signaling[J].Gene,2014,546 (1):73-79.

（2015-09-10收稿）

（2015-10-10修回）

（编辑：周晓颖）

Expression and clinical significance of CtBP2 in human esophageal squamous cell carcinoma

Chengqi GUAN,Mingbing XIAO,Cuihua LU,Wenkai NI,Feng JIANG,Runzhou NI

Department of Gastroenterology,theAffiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001,China
This work was supported by grants from the Youth Science Fund Project of the National Natural Science Foundation of China(No. 81502005)and Nantong Science and Technology Project(No.HS2014038 and HS2014072)

Objective:To explore the expression of C-terminal binding protein 2(CtBP2)in human esophageal carcinoma and its relationship with clinicopathological parameters and survival.Methods:The expression levels of CtBP2 in eight cases of fresh frozen specimens of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and the adjacent esophageal tissues were detected by Western blot.Immunohistochemistry was used to detect CtBP2 expression in 90 samples of ESCC tissues and adjacent non-tumor tissues.Based on patient information and follow-up data,the correlation of CtBP2 expression with patients'clinicopathological characteristics and overall survival was further evaluated using Fisher's exact test and Kaplan-Meier method,respectively.Results:Immunohistochemistry and Western blot analysis showed that CtBP2 expression in tumor tissues was higher than that in adjacent non-tumor tissues.CtBP2 expression was significantly correlated with histologic grade(P=0.002)and depth(P=0.032).Kaplan-Meier analysis demonstrated that high CtBP2 expression was correlated with a short survival time.Conclusion:CtBP2 expression was upregulated in ESCC tissues,indicating that it may play a role in the oncogenesis and development of ESCC.

esophageal squamous cell carcinoma,CtBP2,transcription factor,immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.22.005

南通大学附属医院消化内科（江苏省南通市226001）

*本文课题受国家青年科学基金项目（编号：81502005）和南通市科技计划项目（编号：HS2014038、HS2014072）资助

倪润洲 nirz@163.com

管程齐 专业方向为消化道肿瘤的分子生物学研究。

E-mail：gcq2005@aliyun.com