阿卡波糖类似物的研究进展

张洪志，徐庆阳

（天津科技大学 生物工程学院，天津 300457）

糖水解酶抑制剂，例如淀粉酶抑制剂和葡糖酶抑制剂，是众所周知的治疗和预防糖尿病、高脂蛋白血症、高脂血症、肥胖或由这些疾病引起的其他次要症状的药物。在最早研发新型α-淀粉酶抑制剂的过程中，Geng peng等[1]发现了由天蓝黄链霉菌发酵得到6个化学单体，被确定为阿卡波糖（acarbose）的类似物，它们对猪胰α-淀粉酶具有显著的抑制作用。这些阿卡波糖类似物有一个核心结构，即一个acarviosine中的脱氧葡萄糖单位和一个正常D-葡萄糖单位间形成脱氧葡萄糖苷键，这样三个单元形成一个“假三糖”单位，重复不同次数，形成多种拟低聚糖化合物。另外，在不同重复次数的假三糖单位两侧，还可以连接不同数目的D-葡萄糖单位。据此，将这些拟低聚糖命名为阿卡他定（acarviostatin），即含有 acarviosine核心的低聚糖。以一个罗马数字表示假三糖单位的重复次数，以第一个阿拉伯数字表示非还原端葡萄糖单位的个数，以第二个阿拉伯数字表示还原端葡萄糖单位的个数。图1中的6个拟低聚糖即被命名为阿卡他定I03、阿卡他定II03//阿卡他定III03//阿卡他定IV03、阿卡他定II23和阿卡他定II13[2]。

图1 阿卡波糖类似物化学结构

阿卡波糖类似物（acarbose analogues）与阿卡波糖（acarbose）具有相同的核心结构（acarviose），即由4-氨基-4,6-二脱氧葡萄糖和氨基环醇组成的二单位。因此阿卡波糖类似物拥有与阿卡波糖类似的作用机制，能够显著地抑制α-糖苷酶的活性，延缓碳水化合物在小肠内的水解，以维持机体内血糖水平的稳定。阿卡波糖类似物较阿卡波糖（acarbose）具有更好的抑制活性[2]，所以阿卡波糖类似物可以被开发成为一种新型的治疗Ⅱ型糖尿病的降糖药物，使它具有服用剂量小、作用时间长、安全高效等优点。

1 阿卡波糖类似物合成途径及转运途径

由图2可知，阿卡波糖是一种含氮的假性四糖，包括氨基环醇、4-氨基-4,6-二脱氧葡萄糖和一分子麦芽糖三部分。形成一分子的阿卡波糖，理论上需要二分子的葡萄糖和一分子的麦芽糖[3-5]。

图2 阿卡波糖分子结构图

1.1 阿卡波糖的合成

游动放线菌和链霉菌是阿卡波糖的主要产生菌[4]。近年来，科技工作者一直致力于研究阿卡波糖及其类似物在微生物体内合成的具体路径，以及合成过程中所运用的相关生物酶，以期为该类药物的大工业化生产提供可靠的理论基础。到现在为止，阿卡波糖及其类似物的生物合成路径已经基本清楚，如图3所示[6]。

作为一种典型的C7N-氨基环醇类物质，阿卡波糖由氨基环醇、4-氨基-4,6-双脱氧葡萄糖和一分子麦芽糖三部分组成，其生物合成途径可以概括为以下3个过程[7]。

1.1.1 氨基环醇的合成

1）在环化酶的作用下，7-P-景天庚糖（sedoheptulose7-P）分子内环化得到前体物质2-epi-5-epi-valiolone，再磷酸化生成2-epi-5-epi-valiolone-7-phosphate[8]。C-7位的磷酸化是生物体的一种自我保护机制[9]。有研究证明，在阿卡波糖的合成过程中会生成多种含有C-7环醇和acarviosyl的物质，他们对细胞质中的许多水解酶（如α-葡萄糖苷酶和葡甘露聚糖酶）有抑制作用。当阿卡波糖的氨基环醇C-7位被磷酸化后，微生物体内的糖苷酶等各种生物酶不受阿卡波糖及其类似物的抑制，以保证细胞对各种糖源的利用，用以维持细胞的正常生命代谢活动；2）微生物体内的差向异构酶能够催化2-epi-5-epi-valiolone-7-P发生结构的改变，并最终生成5-epi-valiolone-7-P，这个催化反应是由差向异构酶独自完成的，不需要其他辅助因子的直接参与，而且与任何已知的差向异构酶都没有相似性，所以它很可能代表了一类全新的差向异构酶[8]；3）在NADH-依赖型脱氢酶的作用下，5-epi-valiolone-7-phosphateC-1酮被还原生成 5-epi-valiolol-7-phosphate；4）在脱水酶的作用下，5-epi-valiolone-7-P脱水生成1-epi-valienol-7-phosphate；5）1-epi-valiolone-7-P物质的第一位C原子在生物酶的作用下继续被磷酸化，生成1-epi-valiolone-1,7-diP，对于这一步反应所用到的生物酶还未明确，但这一步反应被认为是最重要的一步反应；6）1-epi-valiolone-1,7-P在ADP-葡萄糖合酶GlgC的催化作用下，最终生成NDP-1-epi-valiolone-7-P，即氨基环醇[6]。

图3 阿卡波糖合成途径

1.1.2 4-氨基-4,6-双脱氧葡萄糖的合成

1）D-1-磷酸葡萄糖（D-glucose-1-phosphate）核苷酸化为dTDP-D-葡萄糖。由dTDP-葡萄糖合成酶（AcbA）催化；2）dTDP-D-葡萄糖生成 dTDP-4-酮-6-脱氧-葡萄糖。由dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶（AcbB）催化；3）dTDP-4-酮-6-脱氧-葡萄糖生成dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧葡萄糖[10]。

1.1.3 阿卡波糖及其类似物的合成

1）NDP-1-epi-valienol-7-P 和 dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-葡萄糖在糖基转移酶的作用下结合生成dTDP-acarviose-7-P。目前的研究认为细胞质内的合成到此为止全部完成，但是dTDP-acarviose-7-P不是唯一的终产物，它还有可能再结合 1～2 个单糖基[6]；2）dTDP-acarviose-7-P 以及结合了不同数目糖基的dTDP-acarviose-7-P-Glc(n)在转运蛋白的帮助下转移至细胞外，然后在转移酶作用下与麦芽糖结合，生成阿卡波糖[12]。事实上，这一过程中还生成了许多阿卡波糖的类似物（图 4）。

图4 阿卡波糖及其类似物

1.2 阿卡波糖类似物的转运途径

当微生物所处的环境中缺少单糖葡萄糖等能源物质时，微生物体内合成的acarbose-7-P以及其他的一些类似物就会通过细胞膜上的转运蛋白转移至菌体外，与环境中存在的多糖链以及寡糖结合生成结构相对复杂的阿卡波糖类似物。然后这种复合物再通过细胞膜上另外一种通道蛋白的转运作用转移至菌体内，在各种生物酶的催化作用下，这种复合物重新水解成阿卡波糖的核心结构（acarviose）和多糖链或者寡糖，多糖或者寡糖进入微生物的代谢系统被菌体吸收，而核心结构（acarviose）在通道蛋白的作用下又被转运到菌体外，连续地进行多糖或者寡糖转运[12]。在转运能源物质的过程中，所生成的复合物在体外酶的作用下能够与核心结构（acarviose）或者其他的多糖链发生化合反应，生成分子结构更为复杂的化合物，由于这类化合物与阿卡波糖一样能够显著地抑制α-糖苷酶的生物活性，因此我们称这类化合物为“阿卡波糖类似物”。阿卡波糖类似物的合成过程如图5所示[2]。

2 阿卡波糖类似物发酵工艺研究

2.1 碳源的影响

阿卡波糖类似物的核心结构（acarviose）是具有假性三糖的结构，这说明该类物质在微生物体内的生物合成与周围环境中的碳源有着非常紧密的联系，碳源的种类以及碳源的浓度都会对菌体的代谢以及目的产物的合成产生巨大的影响，因此优化发酵培养基中的碳源种类以及碳源的浓度对提高阿卡波糖类似物的产量有十分重要的意义。

Choi B T等[13]对放线菌CKD发酵生产阿卡波糖做了深入的研究，研究结果发现葡萄糖、麦芽糖既是阿卡波糖的能源物质又是其合成的前体物质，葡萄糖在发酵早期就被耗尽，而麦芽糖在整个发酵过程中缓慢地被利用，并且在葡萄糖耗尽之后，充当能源物质。同时，因为麦芽糖会直接掺入阿卡波糖的结构中，所以葡萄糖在早期耗完之后，后期麦芽糖含量减少会显著制约阿卡波糖的产量，因此必须严格控制葡萄糖的含量并保持麦芽糖在发酵液中的高浓度来促进阿卡波糖的合成。

程新[14]等人的研究结果表明，当选用麦芽糖和葡萄糖作为发酵培养基和补料培养基中的碳源，且其配比（质量比）分别为 3∶1 和 4∶1 时，最利于阿卡波糖的合成。在游动放线菌A-5.6发酵过程中通过碳源的选择和补加，使发酵液的总糖浓度保持在合适的水平，可以大幅提高阿卡波糖的产量。

2.2 氮源的影响

氮源可以分为有机氮源与无机氮源，有机氮源是指含有氮元素的有机物，比如玉米浆、豆浓、黄豆饼粉、蛋白胨以及酵母粉等；无机氮源分子结构相对简单，属于无机物，比如氯化铵、硝酸铵等[15]。氮源对于微生物的生长具有重要的促进作用，微生物体内蛋白质、核酸分子的生物合成过程均需要氮元素的参与。因此，培养基中氮源的种类以及氮源的浓度对微生物的生长和繁殖均有十分重要的影响。

图5 阿卡波糖类似物合成途径

在阿卡波糖类似物的核心结构（acarviose）中也存在着一个氮原子，说明培养基中的氮源与阿卡波糖类似物的合成有着非常重要的关系。Lee S等[16]采用同位素标记法探索核心结构（acarviose）中N原子的来源，实验结果表明核心结构（acarviose）中的N原子大部分来源于谷氨酸的α-N，少部分来自谷氨酰胺中的α-N以及氯化铵中标记的N原子。这就说明，谷氨酸的α-N是核心结构（acarviose）中N原子的直接来源，谷氨酸可以作为前体物质直接添加到发酵培养基中。

2.3 渗透压的影响

在阿卡波糖的发酵过程中，渗透压对其产量有着决定性的作用。一方面由于在阿卡波糖的生物合成中麦芽糖可直接渗入阿卡波糖的分子结构中，提高培养液的渗透压，可促进麦芽糖向细胞内运输，从而提高阿卡波糖的产率；另一方面，碳源浓度过高会使培养基的渗透压过高，影响菌体的生长和代谢，产生分解代谢物阻遏效应，降低产物的浓度。因此，在发酵过程中，要严格控制培养基的组成及渗透压。Beunink J等[17]利用游动放线菌合成阿卡波糖，发现阿卡波糖的产量与培养液的渗透压有着密切的关系。最适宜的渗透压值为400 mOsm/kg，高于或低于该值，阿卡波糖的产量都会下降，渗透压过高或过低时，甚至没有阿卡波糖的产生。

3 展望

口服α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂因能直接延缓肠道中淀粉的消化和吸收，进而有效降低餐后高血糖，因此已成为最便捷安全有效的一线降糖药物之一。目前市售α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂主要是阿卡波糖的各类制品，其专利为国外机构所有。而目前国内的α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂制品也多是阿卡波糖的仿制品，竞争力较低。因此开发具有自主知识产权的，生物活性强于阿卡波糖的新型α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂具有非常广阔的应用前景。

[1]GENG Peng,MENG Xiansheng,BAI Gang,et al.Profiling of acarviostatin family secondary metabolites secreted by Streptomyces coelicoflavus ZG0656 using ultraperformance liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry[J].Analytical Chemistry,2008,80(19):7554-7561.

[2]耿鹏．天蓝链霉菌及其生产的新型α-淀粉酶抑制剂研究[D]．天津：南开大学，2008．

[3]FLOSS H G,KELLER P J,BEALE J M.Studies on the biosynthesis of antibiotics[J].Journal of Natural Products,1986,49(6):957-970.

[4]ARAKAWA K,BOWERS S G,MICHELS B.Biosynthetic studies on the alpha-glucosidase inhibitor acarbose:the chemical synthesis of isotopically labeled 2-epi-5-epi-valiolone analogs[J].Carbohydrate Research,2003,338(20):2075-2082.

[5]STRATMANN A,MAHMUD T,LEE S,et al.The AcbC protein from Actinoplanes species is a C7-cyclitol synthase related to 3-dehydroquinate synthases and is involved in the biosynthesis of the α-glucosidase inhibitor acarbose[J].Journal of Biological Chemistry,1999,274(16):10889-10896.

[6]顾觉奋，陈菁．阿卡波糖生物合成和发酵工艺研究进展[J]．国外医药：抗生素分册，2006，27(3)：122-125，142．

[7]WEHMEIER U F.The biosynthesis and metabolism of acarbose in Actinoplanes sp.SE 50/110:a progress report[J].Biocatalysis and Biotransformation,2003,21(4-5):279-284.

[8]ZHANG Changsheng,PODESCHWA M,ALTENBACH H J,et al.The acarbose-biosynthetic enzyme AcbO from Actionplanes sp.SE50/110 is a 2-epi-5-epi-valiolone-7-phosphate 2-ep imerase[J].Febs Letters,2003,540(1-3):47-52.

[9]ZHANG Changsheng,PODESCHWA M,BLOCK O,et al.Identification of a 1-epi-valienol-7-kinase activity in the producer of acarbose,Actionplanes sp.SE50/110[J].Febs Letters,2003,540(1-3):53-57.

[10]PIEPERSBERG W,DIAZ-GUARDAMINO P M,STRATMANN A,et al.Recent development in the biosynthesis and regulation of aminoglycosides.In Fierro F,Martin J F,(eds)Microbial secondary metabolites:Biosynthesi,genetics and regulation[M]．Kerala,India:In Research Signpost:Research Signpost,2002:1-26.

[11]CONIFF R,KROL A.Acarbose:A review of US clinical experience[J].Clinical Therapeutics,1997,19(1):16-26.

[12]HEMKER M,STRATMANN A,GOEKE K,et al.Identification,cloning,expression,and characterization of the extracellular acarbose-modifying glycosyltransferase,AcbD,from Actinoplanes sp.strain SE50[J].Journal of Bacteriology,2001,183(15):4484-4492.

[13]CHOI B T,SHIN C S.Reduced formation of byproduct component c in acarbose fermentation by Actinoplanes sp.Ckd485-16[J].Biotechnology Progress,2003,19(6):1677-1682.

[14]程新，黄林，魏赛金，等．阿卡波糖发酵过程中碳源控制策略的研究[J]．中国酿造，2010，31(12)：80-82．

[15]张琴，胡海峰，朱宝泉．阿卡波糖产生菌的选育和发酵工艺优化[J]．中国医药工业杂志，2008，39(11)：820-822．

[16]LEE S,EGELKROUT E.Biosynthetic studies on the alphaglucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp.:Glutamate is the primary source of the nitrogen in acarbose[J].The Jour nal of Antibiotics,1998,51(2):225-227.

[17]BEUNINK J,SCHEDEL M,STEINER U,et al.Osmotically controlled fermentation process for the preparation of acarbose:US,6130072[P].2000-10-10.