一种新式灌流系统在胞磷胆碱合成中的应用

宋 臻

（亚翔系统集成科技（苏州）股份有限公司，江苏 苏州 215000）

引言

胞苷二磷酸胆碱（CytidineDiphosphateCholine，分子结构式见图1，别名胞磷胆碱或CDPC）是卵磷脂生物合成重要的中间产物。卵磷脂是细胞膜的重要组成成分，它的代谢正常与否直接影响细胞的通透性、能量代谢以及蛋白质生物合成等许多生物学功能。1963年，CDPC开始用于临床。实践证明，它对脑损伤引起的意识障碍以及其他神经系统疾病都有较好的疗效，随着社会的发展，CDPC更是作为预防老年痴呆的保健品得到大力的发展[1]。

图1 CDPC分子结构

由于CDPC的广泛应用，其市场需求量正逐步扩大，2007年，根据有关机构调查，CDPC在中国市场的年需求大约为250 t，但当年的供给量不足60 t，有着极大的需求缺口。因此，如何高效率、高质量、低成本的生产CDPC成为企业亟待解决的问题。

将灌流系统应用在CDPC生产中，可以大幅提高产品质量和产量产能，降低产品成本，进而快速填补市场的缺口，增加企业市场竞争力和企业效益。

1 胞磷胆碱的生产方法

1.1 胞磷胆碱生产方法简介

胞磷胆碱的生产方法主要有化学合成法、酶转化法、双菌发酵法和酵母发酵法。化学合成法是利用化工原料，经过逐级多步反应，再经提纯得到最终产品。这种方法研发成功早，但缺点很多，目前只有少数企业在利用此法生产。90年代后日本研发成功并开始采用酵母酶转化法生产胞磷胆碱，此法并非无菌发酵反应，它是利用废旧酵母的多酶体系将胞苷酸（CMP）和辅料合成CDPC，但由于当时主要原料CMP的价格比较高，此法在当时未得到广泛发展。2003年以后，由于CDPC的主要原料CMP的生产技术已经成熟，CMP价格大幅下降，加之经过优化后转化率大幅提高，我国开始大量采用酵母酶转化法生产CDPC，目前市场大部分产品都由此法生产[2-3]。虽然成本问题得到了解决，但酵母酶转化法也暴露了很多新的问题。2000年后日本开发了双菌发酵法，即利用大肠杆菌和产氨棒杆菌等基因工程菌发酵生产CD PC。此法发酵工艺相对复杂，在CMP大幅降价后渐渐被淘汰。

近几年来，随着生物发酵技术的发展，酵母发酵法有了越来越大的优势。此法采用筛选过的高活力酵母为菌种，以CMP为原料采用无菌发酵技术生产CDPC，有菌种来源稳定、菌种活力高、用量少、中间体杂质少、后处理简单等特点[4]。但微生物发酵周期比较长，单位时间设备的产出比较小，需要更大的初期投入才能保证产能。

表1 胞磷胆碱合成方法优缺点比较

1.2 灌流培养生产胞磷胆碱

灌流培养生产CDPC是在酵母发酵法的基础上，利用特殊的设备，一方面源源不断加入培养基和底物，另一方面通过重力沉淀、循环系统和切向过滤源源不断提取出产品，从而实现连续培养的过程。通过此过程，可以在目前企业生产设备的基础上，经过少量的设备改造，极大提高CDPC的产能和产量，提高设备利用率和产品质量，降低产品的成本。

1.2.1 灌流系统的组成

灌流系统由以下几个部分组成：补料系统、循环过滤系统、出料系统、自动控制系统、其他辅助系统（在线清洗系统（CIP系统）和在线灭菌系统（SIP 系统））。

补料系统：向反应釜内补给发酵所需培养基以及CMP底物，需要无菌控制操作，由补料管路、补料罐、动力系统以及辅助的CIP、SIP组成。

循环过滤系统：将罐内反应液从底部提升，通过动力泵（隔膜泵或者蠕动泵）经过切向过滤的过滤器后，再回流到罐内，通过重力沉降，切向过滤可以将料液源源不断循环，进而将不含细胞的反应液导出反应体系，是灌流系统的关键部分。

出料系统：将透过切向过滤膜的无细胞反应液抽离反应体系，由过滤器、动力泵（隔膜泵或者蠕动泵）以及配套管路，容器组成。

控制系统：整个系统的大脑，由PLC控制2台变频动力泵、液位控制器、自动隔膜阀、浊度控制器组成，一方面控制补料和出料的有序性，一方面保证细胞出料的清澈，保证滤膜不会过分堵塞。

其他辅助系统：由于整个系统需要在无菌环境下进行，在中试、放大生产中要符合GMP等相关规范，因此还需要在线清洗系统、在线灭菌系统以及其他辅助系统。

图2 灌流系统

1.2.2 过程和原理

初期细胞培养时，细胞处于恢复期，此时细胞浓度比较低，代谢水平较低，主要利用葡萄糖等易利用底物进行自身增殖，对于利用CMP产生CDPC的能力比较弱，一般恢复期持续的时间比较长，选用有利于细胞生产的营养丰富的培养基可以使细胞快速生长。

进入对数期，当细胞积累达到一定浓度后，源源不断的加入CMP底物，在胆碱激酶和磷酸化酶为主的酶系的作用下，CMP和含有胆碱、磷酸的底物共同作用，发生生物酶反应，产生CDPC。

随着CDPC的累计，当摩尔转化率达到90%的时候，反应趋于平衡，此时继续加入CMP会使得CMP和CDPC的浓度都增加，CDPC增加的速度较慢，摩尔转化率反而降低。此时通过灌流系统，将反应液抽出，抽出后再补料加入培养基和CMP的混合底物，一方面保证细胞的正常生长，一方面可以继续转化生成CDPC。灌流抽出一定的CDPC溶液，并补加适当量的CMP，此时CDPC转化率会从90%立刻跌到70%左右，但由于平衡被破坏，在酶的作用下，CMP继续反应生成CDPC，直到再次达到平衡。

图3 灌流系统

2 酵母发酵法和灌流培养法生产CDPC的实验比较

2.1 菌种

经筛选过的啤酒酵母菌株LP30925（企业内部菌种编号）。

2.1.2 培养基

1）酵母发酵法所用培养基：

培养基1：酵母培养基。

培养基2：在培养基1的基础上进行调配，调配后酵母浓度为3%～7%，磷酸胆碱0.5%～2%，磷酸0.5%～2%，葡萄糖10%～20%，硫酸镁0.1%～0.5%，培养过程需要1～2次补糖，每次3%～10%。

2）灌流培养法所用培养基：

培养基1：酵母培养基。

培养基2：基本同酵母发酵法所用培养基2相同，葡萄糖浓度和补糖浓度同比降低25%～50%。

2.1.3 主要仪器和设备

DZ05A发酵罐、紫外分析仪、电泳仪（槽）、紫外分光光度计、高效液相色谱仪。

2.1.4 培养方法

1）酵母发酵法：将酵母菌株加入到预先灭菌的培养基1中，进行无菌培养，10～15 h进入对数生长期，15～25 h后酵母浓度达到3%～7%，此时加入CMP、磷酸胆碱、糖等辅料，调配成培养基2的浓度进行反应，反应30 h左右，摩尔转化率可以达到90%以上（折算重量转化率142%）；然后经过机械过滤、层析柱层析、减压浓缩、甲乙醇结晶得到成品固体CDPC。

2）灌流培养法：30 h前培养方法同酵母发酵法，反应30 h左右，摩尔转化率可以达到90%以上 （折算重量转化率142%）；此刻酵母浓度为9.5%以上，开始灌流，每2 h从罐内抽出25%体积的反应液，并补入同体积含适当CMP浓度的培养基，抽取补料过程消耗时间约20 min，剩余100 min为反应时间，100 min后，转化率可再次达到90%，再次循环灌流，期间酵母浓度稳定在9.5%～11%之间，缓慢提升。灌流72～96 h后，细胞活力下降，灭菌放罐结束反应并进行清洗灭菌等操作。

经试验，灌流培养在转化率达到平衡后可以维持72～96 h，最终因为酵母浓度过高，衰亡酵母自溶产物过多导致灌流系统能力下降，此时考虑结束灌流培养，采用和旧法相同的灭活过滤方法获得最终产品。

2.1.5 主要分析方法

1）酵母浓度检测：离心管称重，记为m1；称取酵母发酵液样品，计为m2，5000 r/min离心5 min后去上清，倒扣静置1 min，擦拭离心管口的残液后称重，计为m3。酵母浓度根据以下公式计算：

酵母浓度C=(m3-m1)/(m2-m1)×100%。

此法检测的酵母浓度为湿酵母浓度。

2）酵母摩尔转化率快速检测法：因为发酵液包含杂质很多，对色谱柱损伤比较大，加上HPLC检测时间较长（一般30～40 min），在生产中一般使用酵母摩尔转化率快速检测法。

取酵母发酵液样品离心后的上清液，取样10 μL点入预先制备好的四硼酸钠—琼脂糖电泳凝胶中，在电泳槽内200～300 V电压跑板3～6 min，在254 nm紫外灯下查看会出现清晰的两条紫外吸收带，其中远端为CDPC，近端为CMP，割胶（含空白），把三段凝胶分别放入装有5 mL pH 2.0的盐酸溶液试管中，沸水浴3～5 min融胶，静置放冷，在280 nm紫外分光光度计下以空白为对照测量光吸收率 （非OD值），CMP和CDPC光吸收值分别为Acmp和Acdpc，转化率根据以下公式计算：

转化率T=Acdpc/(Acmp+Acdpc)×100%。

此法速度比药典HPLC法一般要快10～20 min，精度和药典HPLC法最大相差3%，适用于生产中间体控制，本文发酵过程的转化率数据是依据此法测定得出。

3）色度检测法：色度是CDPC成品的瓶颈指标，其主要产生于酵母分解产生的黄色色素，在过程中以测定溶液的A430作为色度指标。取酵母发酵液样品离心后的上清液，以纯化水为对照测定A430，即为色度指标。

4）成品收率：成品收率 =CDPC固体成品重量/投入的CMP重量 ×100%，由于发酵后段收率基本恒定，也可以用发酵液色谱定量乘以一定的损耗系数进行计算。

3 结果与讨论

酵母培养和灌流培养至10～15 h，酵母进入对数生长期，酵母浓度快速增加；15～25 h后酵母浓度达到3%～7%，此时加入CMP、磷酸胆碱、糖等辅料，调配成培养基2的浓度进行反应，酵母浓度和CDPC摩尔转化率快速增长；反应30 h左右，酵母浓度和摩尔转化率趋于稳定（图4、5）。

酵母培养在30 h后做灭活、放罐处理，若继续培养，酵母会进入衰亡期导致浓度下降，CDPC摩尔转化率则受产物反馈抑制，停止增长。灌流培养由于源源不断补充新鲜的培养基，能维持酵母浓度的缓慢增长，灌流培养每次分离提取掉1/4罐体积的CDPC溶液，并补充新的CMP底物，因为破坏了反应平衡，使得CDPC可以继续得到转化。由于稀释作用，使得CDPC转化率曲线呈现锯齿状。72～96 h后做灭活、放罐处理。

图4 酵母浓度—时间的关系曲线

图5 摩尔转化率—时间的关系曲线

从表2看出，灌流培养可以拉长有效反应时间，使得灌流培养前期种子细胞复苏时间和后处理时间比重大大降低，单位时间收获到更多的产品，提高了设备的利用率，灌流培养的产能是非灌流法的3.96倍，大幅降低了生产成本。

色度是CDPC成品的瓶颈指标，在过程中以测定溶液的A430作为色度指标，CDPC溶液的色度越低，表明产品的质量越高。表3可以看出，酵母培养CDPC溶液色度质量为0.788，灌流培养CDPC溶液色度质量为0.176。灌流培养CDPC溶液色度（A430值）与非灌流法相比，降低了77.7%，产品质量显著提高。原因是灌流培养弱化了高温灭活操作，减少了细胞破损产生的杂质，使得溶液色度降低，另外纯度的增加也有利于后处理收率的提高和成品质量的提高。

4 结论

将灌流系统应用在CDPC生产中，可以大幅提高产品质量，提高产能，降低产品成本，进而快速填补市场的缺口，增加企业市场竞争力和企业效益。

表2 酵母发酵法和酵母发酵法灌流培养产量和产能对比

表3 酵母发酵法和酵母发酵法灌流培养质量（色度）对比

[1]刘然江．胞磷胆碱：循证医学证据最强的神经保护药物[J]．中国药房，2011，22(12)：1071-1071.

[2]候立向，赵 ．胞二磷胆碱的发酵合成及其纯化[J]．生物化学与生物物理进展，1979(5)：40-48．

[3]徐仁华，徐敏，郁其平．胞二磷胆碱钠的制备方法：中国，200610 096512.8[P]，2006-09-28．

[4]邱蔚然，周长林，王鹏飞，等．一种生物转化胞磷胆碱的酿酒酵母菌种及应用：中国，201310358526.2[P]．2013-08-15．