响应面法优化植物抗氧化剂降低培根亚硝胺残留量的工艺

王永丽，李　锋，陈文彬，陈　肖，黄明明，黎良浩，章建浩，*

（1.南京农业大学食品科技学院，国家肉品质量与安全控制工程技术研究中心，江苏南京210095；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018）

响应面法优化植物抗氧化剂降低培根亚硝胺残留量的工艺

王永丽1，李锋2，陈文彬1，陈肖1，黄明明1，黎良浩1，章建浩1，*

（1.南京农业大学食品科技学院，国家肉品质量与安全控制工程技术研究中心，江苏南京210095；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018）

为探讨植物抗氧化剂降低培根中亚硝胺残留量的最适添加量，在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken响应面法研究了培根腌制风干过程中茶多酚添加量、葡萄籽提取物与亚硝酸钠添加量对亚硝胺的影响，模拟得到了二次多项式回归方程的预测模型。结果表明植物抗氧化剂能有效降低亚硝胺残留量，最佳添加量为：茶多酚310mg/kg，葡萄籽提取物420mg/kg，亚硝酸钠120mg/kg。在此条件下，N-二甲基亚硝胺的残留量为0.325μg/kg，与模型预测值0.3395μg/kg吻合良好，说明优化出的回归方程对于生产实际有一定的理论指导意义。

培根，茶多酚，葡萄籽提取物，亚硝胺，响应面法

培根是流行于欧美的一种重要腌腊肉制品，在我国也有类似西式培根的腌腊肉产品，主要集中在我国西南地区。培根在烟熏、发酵成熟过程中会产生一些强致癌性的N-二甲基亚硝胺（NDMA），摄入体内后可诱发食道癌以及其它消化系统疾病[1-3]。亚硝酸盐是肉制品生产过程中重要的食品添加剂，它对于肉品的色泽、质构和风味均有积极的影响，同时它还具有防腐作用[4-7]。但是，亚硝酸钠会和肉中的胺类反应产生强致癌物质——亚硝胺[8-9]。因此，研究降低腌腊肉制品中亚硝酸盐、亚硝胺残留水平的新工艺对于提高腌腊肉的安全水平具有重要意义。茶多酚和葡萄籽提取物作为抗氧化剂应用于腌腊肉制品的加工，可以抑制氧化，控制腐败微生物生长，低浓度茶多酚（500mg/kg）和葡萄籽提取物（＜0.2%）添加量，可以提高产品的色泽、风味及感官品质[10-11]。但其对肉制品中亚硝胺抑制效应的研究很少，本实验选择天然来源的茶多酚和葡萄籽提取物等抗氧化剂为阻断剂，研究了其对培根中亚硝胺残留量的影响，并采用响应面法优化了其在培根加工过程中抑制亚硝胺生成的最佳配比，以期改进腌腊肉制品的生产工艺，提高其安全品质，为生产实践提供一定的实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

五花肉南京苏果超市卫岗店；食品级亚硝酸钠（≥99%） 天津科密欧试剂有限公司；挥发性N-二甲基亚硝胺（NDMA） 美国Sigma公司；茶多酚（≥98%）、葡萄籽提取物（≥95%） 南京泽朗生物科技有限公司；二氯甲烷、甲醇、氢氧化钠、盐酸等所用其他试剂均为分析纯。

JA2203N电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司；SPX-250C型恒温恒湿箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KH-400KDB型高功率数控超声波清洗器昆山禾创超声仪器有限公司；Allegra 64 R型高速冷冻离心机美国Beckman Coulter公司；IKAT18basic型高速分散机德国IKA公司；Agilent 7890A/5975C气质联用仪美国Agilent公司。

1.2实验方法

1.2.1培根加工及取样将新鲜五花肉分割成20cm× 15cm×5cm长方块，在4℃下冷却24h。然后，从中随机抽取三块作为原料对照组进行测定。五花肉块用2%（g/100g）的食盐擦涂表面，于4℃、相对湿度85%～90%条件下腌制3d。腌制结束后，将样品转移到控温控湿培养箱中风干成熟12d，温湿度设置为：起始温度13℃、升温速率1.5℃/d；环境湿度85%，下降速率0.5%/d[12]。实验结束后，分别取10g表面和中间部位的肌肉，切碎、混匀，避光真空包装，-40℃条件下冷藏备用。

1.2.2N-二甲基亚硝胺残留量的测定

1.2.2.1样品预处理准确称取切碎并混匀的样品20.0g，加入适量的无水硫酸钠混匀，用重蒸二氯甲烷超声提取3次，每次60mL二氯甲烷15min超声提取，利用250mL分液漏斗分离有机溶剂相，经10g无水硫酸钠过滤脱水后，收集到平底烧瓶，在50℃水浴下抽真空浓缩至10mL左右，再用氮吹仪浓缩近干，用色谱甲醇定容至1.0mL，过0.45μm微孔滤膜，上机测定[13]。

1.2.2.2GC-MS仪器条件色谱柱为HP-5MS毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm），进样口温度：230℃，不分流进样；采用程序升温：初始温度50℃，保持2min，以8℃/min升至150℃，保持5min，然后以20℃/min升至250℃，保持2min；载气为高纯氦气（99.999%），流速1mL/min；电子轰击（EI）离子源；电子倍增器电压1301ev；电离电压70ev；离子源和四极杆温度分别为230℃和250℃；测定采用SIM/全扫描（SCAN）采集模式，扫描质量范围：30～150m/z，溶剂延迟时间2.5min，进样量为1μL。采用外标法进行N-二甲基亚硝胺定量计算。

1.2.3单因素实验

1.2.3.1茶多酚添加量对挥发性N-二甲基亚硝胺残留量影响研究五花肉上盐阶段，固定葡萄籽提取物的添加量为400mg/kg，亚硝酸钠的添加量为120mg/kg，然后按照茶多酚0、100、200、300、400、500mg/kg不同的浓度添加，将腌制剂及抗氧化剂均匀涂抹在五花肉表面，腌制及风干操作同1.2.1。

1.2.3.2葡萄籽提取物添加量对挥发性N-二甲基亚硝胺残留量影响研究五花肉上盐阶段，固定茶多酚的添加量为300mg/kg，亚硝酸钠的添加量为120mg/kg，然后按照葡萄籽提取物0、200、300、400、500、600mg/kg不同的浓度添加，将腌制剂及抗氧化剂均匀涂抹在五花肉表面，腌制及风干操作同1.2.1。

1.2.3.3亚硝酸钠添加量对挥发性N-二甲基亚硝胺残留量影响研究五花肉上盐阶段，固定茶多酚的添加量为300mg/kg，葡萄籽提取物的添加量为400mg/kg，然后按照亚硝酸钠0、60、90、120、150、180mg/kg不同的浓度添加，将腌制剂及抗氧化剂均匀涂抹在五花肉表面，腌制及风干操作同1.2.1。

1.2.4响应面实验方法在单因素实验的基础上，以茶多酚、葡萄籽提取物、亚硝酸钠添加量为因子，以N-二甲基亚硝胺残留量为评价指标进行响应面优化分析。实验因素水平见表1。

表1　响应面实验设计因素及水平Table.1　Variables and their levels used in response surface experiment

1.2.5数据分析响应面实验结果利用最小二乘法进行二次多项式回归统计分析，其基本模型如下：

Y=β0+∑βiXi+∑βiiXii2+∑∑βijXiXj

式中：β0，βi，βii和βij是回归系数；Xi和Xj代表不同的自变量；Y代表响应变量。

图1　茶多酚添加量对N-二甲基亚硝胺残留量的影响Fig.1　Effect of tea polyphenols addition on NDMA residue in bacons

2　结果与分析

2.1单因素实验结果及分析

2.1.1茶多酚添加量对挥发性N-二甲基亚硝胺残留量的影响由图1可以看出，与对照相比，在腌制阶段添加茶多酚可以有效降低NDMA残留量，并且随着其添加量的增加，NDMA逐渐降低；当茶多酚添加量为300mg/kg时，NDMA残留量最低，为0.36μg/kg，比对照组下降了37.09%；而后NDMA值趋于稳定。这可能是由于茶多酚富含酚羟基，可以解离出H+，H+能与亚硝酸反应，消耗亚硝酸根，而亚硝酸根是亚硝胺的前体物质，从而降低了NDMA的形成[14-15]，故选择茶多酚添加量为300mg/kg。

2.1.2葡萄籽提取物添加量对挥发性N-二甲基亚硝胺残留量的影响由图2可见，在腌制阶段加入葡萄籽提取物后，NDMA残留量不断降低；当葡萄籽提取物添加量为400mg/kg时，培根中NDMA含量最低，为0.37μg/kg，然后趋向稳定。葡萄籽提取物是酚类化合物，能释放其羟基上的活泼氢，捕获自由基，阻断自由基的链式反应，使亚硝酸盐转变成一氧化氮，阻断亚硝胺生成。而且，葡萄籽提取物有强抑菌效果，可与蛋白质之间的多位点结合抑制微生物生长，防止微生物降解蛋白质为胺类物质和氨基酸[16-17]。故选择葡萄籽提取物添加量为400mg/kg。

图2　葡萄籽提取物添加量对N-二甲基亚硝胺残留量的影响Fig.2　Effect of grape seed extracts addition on NDMA residue in bacons

2.1.3亚硝酸钠添加量对挥发性N-二甲基亚硝胺残留量的影响由图3可以看出，亚硝酸钠添加量在60～120mg/kg时，NDMA残留量缓慢增加；当亚硝酸钠添加量大于120mg/kg时，NDMA残留量呈现快速增加趋势。这可能是在低亚硝酸钠添加量时，茶多酚和葡萄籽提取物作为强还原剂，可使亚硝酸、亚硝酸盐或三氧化二氮还原为一氧化氮，阻断亚硝胺的生成[18]；当亚硝酸钠添加量大于120mg/kg时，亚硝酸盐处于过饱和状态，而与亚硝胺的另一前体物质生物胺反应生成NDMA[19]。

图3　添加亚硝酸钠对N-二甲基亚硝胺残留量的影响Fig.3　Effect of sodium nitrite addition on NDMA residue in bacons

2.2响应面实验结果及分析

2.2.1回归模型建立及显著性分析根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，综合分析单因素实验结果，选取对NDMA残留量影响显著的茶多酚添加量、葡萄籽提取物添加量和亚硝酸钠添加量，设计了3因素3水平的响应面分析实验，实验结果见表2。

表2　响应面设计及结果Table.2　Experiment design and results of response surface analysis

该实验共包括17个实验点，可分为两类：一类是析因点，为自变量取值所构成的三维顶点，共包括12个实验点；其二是零点，为区域的中心点，零点实验重复5次，用以估计实验误差。以NDMA残留量为响应值，利用Design-Expert 6.0软件对表2中的数据进行二次多项式回归拟合，得到NDMA对自变量的多元回归方程为：Y=4.76288-0.00444×A-0.00625875× B-0.040096×C-1.60E-006×AB+1.16667E-006×AC+ 2.58333E-006×BC+8.01250E-006×A2+7.68750E-006×B2+1.59861E-004×C2。

由表3方差分析结果可以看出，上述回归模型极显著（p＜0.0001），失拟性不显著（p=0.6329＞0.05），方程的决定系数（R2）和校正决定系数（R2adj）分别为0.99和0.98，说明该模型能解释98%响应值的变化，该模型的拟合度高，实验误差小，能够用于分析茶多酚、葡萄籽提取物以及亚硝酸钠对NDMA的交互作用及对NDMA残留量进行预测。

各因素的显著性检验表明：一次项中B对于响应值的影响极显著（p＜0.001），A和C对响应值的影响显著（p＜0.05），而所有的二次项对NDMA残留量的影响均极显著（p＜0.0001）；交互项中，茶多酚与葡萄籽提取物的交互作用（AB）对NDMA残留量影响显著（p＜0.05），其余交互项影响不显著。这些结果表明，在干腌培根加工过程中，茶多酚和葡萄籽提取物的添加量对NDMA有着非常重要的抑制作用[18]，它们的影响是非线性的。由于在实际加工过程中，各个因素往往同时起作用，因此研究它们的交互作用对抑制生产过程中NDMA的生成具有重要意义。

表3　回归模型方差分析表Table.3　Analysis of variance of regression equation

2.2.2茶多酚和葡萄籽提取物添加量对NDMA的交互作用通过回归模型绘制响应面是评价两因素对响应变量交互作用最常用的方法，通过它们的形状可以反映出两实验因素之间的交互作用是否显著，比如曲率比较大的椭圆形曲面表示两因素的交互作用显著，而曲率小的则相反[20]。

图4是固定亚硝酸钠添加量为120mg/kg，茶多酚和葡萄籽提取物添加量对NDMA残留量的响应面。响应面的形状反映了因素对变量的交互作用，曲率越大，表明交互作用越显著，反之越弱。从图4中可以看出，茶多酚和葡萄籽提取物添加量对NDMA残留量具有明显的交互作用，影响NDMA残留量的葡萄籽提取物临界值随着培根腌制过程中茶多酚浓度的增加而增加。当茶多酚添加量为200mg/kg时，该临界值约为403.9mg/kg；当茶多酚浓度增加到300mg/kg时，临界值增加到418.1mg/kg。

图4　茶多酚和葡萄籽提取物对NDMA残留量交互作用的响应面图Fig.4　The response surface of the addition of tea polyphenols and grape seed extracts on NDMA content

不同茶多酚添加量对葡萄籽提取物临界值的影响结果见表4。将表4中的葡萄籽提取物浓度临界值对茶多酚添加量进行线性回归分析，可以看出葡萄籽提取物浓度对NDMA残留量影响的临界值随着茶多酚添加量的增大呈线性增加（y=0.1051x+385.71，R2=0.989）。NDMA残留量随茶多酚添加量的增加呈线性下降，当茶多酚添加量为300mg/kg时，NDMA值为0.340μg/kg，这表明茶多酚和葡萄籽提取物对NDMA残留量的清除效果显著，并且协同效果比单一抗氧化剂好。

表4　不同茶多酚添加量条件下葡萄籽提取物对NDMA残留量影响的浓度临界值Table.4　The critical values of grape seed extract upon the addition of different levels of tea polyphenol

表5　不同葡萄籽提取物添加量条件下茶多酚对NDMA残留量影响的浓度临界值Table.5　The critical values of tea polyphenol upon the addition of different levels of grape seed extract

对于茶多酚添加量的临界值，当葡萄籽提取物的添加量在0～400mg/kg时，呈现增加的趋势，而NDMA残留量降低，说明在培根的加工过程中，茶多酚与葡萄籽提取物协同抑制NDMA的生成。具体关于葡萄籽提取物添加量对于茶多酚的添加量临界值及NDMA残留量的影响结果见表5。当葡萄籽提取物添加量大于400mg/kg时，NDMA残留量开始升高。因此葡萄籽提取物的添加浓度应小于500mg/kg，考虑到培根产品的感官品质，以400mg/kg为响应面的中心浓度合适。

由表5可知，当葡萄籽添加浓度为400mg/kg时，茶多酚的临界值为308.3mg/kg，这与单因素实验结果基本一致。葡萄籽提取物对茶多酚浓度临界值进行线性回归分析的结果（y=0.1x+268.3，R2=1），表明茶多酚影响NDMA残留量的临界浓度随着葡萄籽提取物浓度的升高呈上升趋势。

2.3验证实验

为降低培根中的NDMA残留量，由响应面实验得到的抗氧化剂最佳添加量为：茶多酚310.10mg/kg，葡萄籽提取物419.03mg/kg，亚硝酸钠120.88mg/kg，在此工艺下，培根中NDMA残留量预测值为0.3395μg/kg。考虑到实际情况，校正最优添加量为：葡萄籽提取物420mg/kg，茶多酚310mg/kg，亚硝酸钠120mg/kg。在此条件下，做3次平行实验，检测培根中NDMA残留量为0.325μg/kg，与预测值相比误差为0.04%，这表明该模型的预测效果良好，响应面模型优化实验结果可靠。

3　结论

研究了茶多酚、葡萄籽提取物和亚硝酸盐添加量抑制培根中NDMA残留量的影响，并采用响应面法对培根腌制加工工艺进行优化，通过回归分析建立了NDMA的二次多项式预测模型。由回归方程得到的最佳抗氧化剂添加量为：茶多酚310mg/kg，葡萄籽提取物420mg/kg，亚硝酸钠120mg/kg，在此条件下NDMA实测值为0.325μg/kg，与预测值吻合良好，说明该模型能很好地预测培根的NDMA残留量。

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Optimization of process of reducing N-nitrosamines content in bacons using plant antioxidants by response surface methodology

WANG Yong-li1，LI Feng2，CHEN Wen-bin1，CHEN Xiao1，HUANG Ming-ming1，LI Liang-hao1，ZHANG Jianhao1，*
（1.National Central of Meat Quality and Safety Control，College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China）

In order to obtain the optimum addition of plant antioxidants to reduce the N-nitrosamines content in bacons，three key factors including tea polyphenols concentration，grape seed extract dose and sodium nitrite levels were optimized using the Box-Behnken response surface methodology based on single-factor experiment. Results showed that plant antioxidants could effectively reduce N-nitrosamines residues，and the optimum addition of plant antioxidants were as follows：tea polyphenol 310mg/kg，grape seed extract 420mg/kg and sodium nitrite 120mg/kg.Under these conditions，N-nitrosodimethylamine（NDMA）residue was 0.325μg/kg，which was close to the theoretical values of 0.3395μg/kg.These findings indicated that the optimized regression equation was of theoretical significance to guide the actual production.

bacons；tea polyphenols；grape seed extract；N-nitrosamines；response surface methodology

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0296-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.056

2014－05－21

王永丽（1983-），女，博士研究生，研究方向：畜产品加工与质量控制。

章建浩（1961-），男，博士，教授，研究方向：畜产品加工与质量控制。

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD28B01）；国家公益性行业（农业）科研专项（201303082-2）；国家自然科学基金青年科学基金（31201417）；中国博士后科学基金（2013M540561）。