CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中比例与乳腺癌远处转移关系

王斌 熊健 只向成

·临床研究与应用·

CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中比例与乳腺癌远处转移关系

王斌①熊健②只向成①

目的：旨在探讨CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中的比例与乳腺癌远处转移之间关系。方法：随机选取2003年1月至2004年10月于天津医科大学肿瘤医院确诊的乳腺癌患者60例，并将其分为30例转移组及30例非转移组（对照组）。免疫组织化学双重染色技术检测60例患者石蜡切片中CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中所占比例，分析其与远处转移之间关系。结果：转移组与对照组中CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中所占比例具有显著性差异（χ2=11.334，P＜0.05）。骨转移中CD44+/ CD24-细胞在乳腺癌组织中比例有显著性差异（χ2=9.250，P=0.01）。CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中5年无瘤生存期比例有显著性差异（χ2=8.058，P=0.005）。结论：CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中所占比例与乳腺癌远处转移密切相关，特别是骨转移。

CD44+/CD24-细胞 乳腺癌干细胞 远处转移 骨转移

肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC）是一种特殊类型的干细胞，具有高度增殖能力与自我更新能力，也具有多向分化的潜能［1］。乳腺肿瘤由不同种群的细胞构成，但目前对于其导致肿瘤发展的理论仍不清楚，其一认为所有种群的细胞通过累计突变，均具有肿瘤源性；其二则认为一少部分细胞，具有干细胞样特点，能够自我更新及多向分化，最终发展成为肿瘤［2］。乳腺癌干细胞理论对乳腺癌治疗有重要意义，多采用杀伤增殖中细胞，但乳腺癌干细胞的细胞周期较慢、增殖不活跃，目前的治疗方案对乳腺癌干细胞的效果不佳，这有可能是导致乳腺癌治疗失败，造成复发及转移的原因之一。因此，将乳腺癌干细胞体内、体外研究的结果应用于临床非常重要。本研究旨在阐明CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中比例与远处转移的关系，分析其对预后的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例选择 2003年1月至2004年10月于天津医科大学肿瘤医院收治确诊为乳腺癌远处转移的病例为171例。53例于本院术后病理确诊为乳腺癌，选取其中资料及组织标本完整的病例30例为转移组，均为女性，年龄30～69岁，中位年龄47.5岁。同时随机选取本院乳腺科2003年1月诊治的乳腺癌患者30例作为对照组，随访10年均未发生局部复发及远处转移，年龄31～75岁，中位年龄49.5岁。所选病例均为单侧乳腺癌，该研究获得本院伦理委员会认可。随机选取60例转移组与对照组患者临床病理资料见表1。

1.2 方法

选取转移组与对照组60例石蜡包埋组织标本进行切片，应用免疫组织化学双重染色技术对CD44及CD24细胞进行染色。

1.2.1 免疫组织化学S-P法单染对照 为与CD44和CD24细胞免疫组织化学双重染色形成对照，证实双染的可信程度，即在同一标本连续切片，选取两张连续石蜡切片，分别对CD44及CD24细胞进行单染，然后和双染切片进行对比。单染过程中，一抗仍为CD44（clone 156-3C11）和CD24（clone SN3b），均购自美国Neomarkers公司。实验前蜡块处理、切片，抗原修复等过程均与双染相同，单染CD44细胞时，DAB显色后即行苏木精染核，然后行盐酸酒精分化，氨水返蓝，于80%、95%、无水酒精中依次将切片浸泡10 min进行脱水，将切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min，取出切片行树脂胶封片。单染CD24细胞时，选用AEC染色后仍用水溶性封片剂封片。结果显示，单染对照与双染结果相同。

1.2.2 病理结果判定 光镜下双染结果由两位病理医师进行判定计数，采用双盲法。CD44细胞DAB染色显示褐色，为细胞膜着色。CD24细胞AEC染色显示红色，为细胞膜及胞质着色。CD44+/CD24-细胞显示细胞膜着褐色，而CD24+细胞的细胞膜、胞质显示红色；CD44+/CD24+细胞的胞膜显示棕色，胞质显示红色。可评估CD44+/CD24-细胞在整个肿瘤区域百分比。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计数资料间的比较采用χ2检验，单因素生存分析采用Ka﹣plan-Meier方法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CD44+/CD24-细胞的鉴别

30例转移组及30例对照组行免疫组织化学双重染色，CD44+细胞在乳腺癌组织中表达呈褐色，CD24+细胞表达呈红色。因此，CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中表达呈褐色（图1A），区别于单纯CD24+细胞胞膜呈红色表达，与CD44+/CD24+细胞胞膜表达呈棕色（图1B）也有所区别。CD24+细胞的胞质也呈红色表达，更可区分CD44+/CD24-细胞与CD44+/CD24+细胞。转移组与对照组两组的CD44+/ CD24-细胞在乳腺癌组织中比例均由病理医师镜下观察计数。

图1 CD44+/CD24-与CD44+/CD24+细胞的免疫组织化学双重染色比较Figure 1 Comparison of double-staining results for CD44+/CD24-cells and CD44+/CD24+cells

2.2 转移组与对照组中CD44+/CD24-细胞比例比较

镜下行每张切片中CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中百分比计数，转移组中为0～80%，而对照组中为0～60%。将该百分比划分为低度表达组（0～25%）、中度表达组（26%～50%）、高度表达组（＞50%）3个组。转移组中低度表达组为26.7%（8/ 30）、中度表达组为60.0%（18/30）、高度表达组为13.3%（4/30），中位百分数为40.0%；对照组中低度表达组为70.0%（21/30）、中度表达组为23.3%（7/ 30）、高度表达组为6.7%（2/30），中位百分数为10.0%。CD44+/CD24-细胞在两组乳腺癌组织中百分比之间的比较存在显著性差异（χ2=11.334，P＜0.05，表2）。

表1 60例乳腺癌患者临床病理资料Table 1 Clinical data on 60 breast cancer cases

2.3 CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中百分比与骨转移的关系

CD44+/CD24-细胞在转移组与对照组的乳腺癌组织中百分比之间比较存在显著性差异，与远处转移相关。30例转移组中骨转移20例（66.7%）、肝转移5例（16.7%）、肺转移4例（13.3%）、脑转移1例（3.3%）。在骨转移中CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中百分比有显著性差异（χ2=9.250，P=0.01）。30例转移组中CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中百分比与骨转移的关系见表3。

表2 转移组与对照组CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中百分比的比较Table 2 Comparison of the metastasis and control groups in terms of the prevalence of CD44+/CD24-cells

无瘤生存期在中、高度表达组为12个月、低度表达组为25个月，中位无瘤生存期为15个月，中、高度表达组5年无瘤生存期明显低于低度表达组，CD44+/ CD24-细胞在乳腺癌组织中百分比与5年无瘤生存期存在显著性差异（χ2=8.058，P=0.005，图2）。CD44+/ CD24-细胞在乳腺癌组织中百分比与总生存期无显著性差异（χ2=2.002，P=0.157，图3）。

图2 CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中百分比与5年无瘤生存期曲线Figure 2 Prevalence of CD44+/CD24-cells in breast cancer tissue and five-year DFS curves

图3 CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中百分比与总生存期曲线Figure 3 Prevalence of CD44+/CD24-cells in breast cancer tissue and overall survival curves

3 讨论

CSC具有高度增殖能力、自我更新能力及多向分化的潜能，是一种特殊类型的干细胞。CSC增殖过程是通过不对称分裂，由一个CSC分裂形成一个新的CSC及一个可最终分化为包括肿瘤细胞在内的各种细胞的子细胞，其结果是维持CSC数目稳定并发生肿瘤［1］。乳腺癌干细胞理论对乳腺癌治疗的重要性［3-5］越来越受到重视，现多采用对增殖过程的细胞杀伤治疗。通常认为乳腺癌干细胞的细胞周期缓慢，增殖不活跃，因此乳腺癌干细胞治疗的效果有限［6］，可能是造成乳腺癌治疗失败引起复发转移的原因之一。乳腺癌干细胞应用于临床的研究表明，CD44+/ CD24-细胞在癌组织中比例对乳腺癌局部复发无影响，但与远处转移可能有关［7］。有研究显示，存在CD44+/CD24-亚细胞群的细胞系比其他细胞系更具有侵袭性，乳腺癌13个细胞系中MDA-MB-231、MDAMB-436、Hs578T、SUM1315和HBL-100细胞系的CD44+/CD24-细胞比例均超过30%，其中MDA-MB-231细胞系与远处转移有关［8］。

表3 CD44+/CD24-细胞在肿瘤组织中百分比与骨转移的关系Table 3 Relationship between the prevalence of CD44+/CD24-cells and osseous metastasis

几十年前肿瘤干细胞起源的问题就被提出，但因当时对于干细胞研究的实验设备较少，不能够提供充分可靠的实验证据而被搁置［9-11］。近几年随着实验技术的发展，以及对之前搜集数据的重新评价，才得以从干细胞层次上对癌症进行研究。肿瘤干细胞具有抵御传统抗肿瘤治疗的杀伤能力，进而出现远处转移［2，12-13］，肿瘤发生远处转移是一个复杂的过程，不仅包括浸润，而且还要在远隔部位进行定位、增殖［14］。乳腺癌中能够形成远处转移的细胞应具有表达浸润/远处转移的相关基因、浸润性、远隔部位定位并增殖三个特点。研究发现，乳腺癌细胞系中具有高比例CD44+/CD24-细胞的细胞系具有高度浸润的特点，并且能够浸润到基质中［9］。因此对于乳腺癌中CD44+/CD24-细胞的研究就显得格外重要，目前主要研究是针对CD44+/CD24-细胞在诊断中的重要性，以及通过临床实验研究的乳腺癌干细胞理论应用于临床实际的可行性。

本研究应用免疫组织化学双重染色方法，对在体内、体外已证实的CD44+/CD24-细胞是否存在于乳腺癌组织石蜡包埋切片中进行鉴别。国外曾有关于这方面的报道［9］，CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中的比例与乳腺癌进展、复发无必然相关性，与本研究中CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中比例无显著性差异是一致的。同时本研究证明CD44+/CD24-细胞在乳腺癌组织中比例与远处转移具有相关性，特别是对于骨转移，显示了CD44作为远处转移定位受体的重要意义，CD44表达的细胞系具有高度的细胞活动性［15］。本研究结果显示，CD44+/CD24-细胞的抗原性虽不能完全反映乳腺上皮肿瘤的肿瘤特性，但CD44+/CD24-细胞有可能成为肿瘤遗传细胞的一个亚细胞群。在动物实验中［2］，分离出的CD44+/CD24-细胞1/9不具有肿瘤遗传特点。在个别病例中甚至出现CD24+细胞显示肿瘤遗传性的特点［2］，由于肿瘤遗传性包括复杂的生物学机制，单细胞可能不能充分证明其具有肿瘤遗传性。CD44+/CD24-表达的细胞是乳腺癌中具有肿瘤遗传性的细胞，但在肿瘤遗传性中表现的功能关联性尚不清楚。

鉴于干细胞在乳腺癌中的重要性，继续研究乳腺癌干细胞其他的特点是必要的，对治疗乳腺癌以及发现新的靶向治疗药物非常重要。

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（2014-09-10收稿）

（2015-05-19修回）

Relationship between the prevalence of CD44+/CD24-cells and distant metastasis in breast cancer

Bin WANG1,Jian XIONG2,Xiangcheng ZHI1
No.2 Department of Breast Cancer,1Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Treatment,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Medical University,Ministry of Education,Tianjin 300060,China;2General Surgery Department,Ge Zhouba Center Hospital,Yichang 443002,China.

Xiangcheng ZHI;E-mail:86496007@qq.com

Objective:To examine the relationship between the prevalence of CD44+/CD24-cells and distant metastasis in breast cancer tissue.Methods:A total of 60 breast cancer patients who had been admitted to Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital between January 2003 and October 2004 were randomly selected.Our cases were divided into metastasis and non-metastasis (control)groups.The CD44+/CD24-cells were identified through double-staining immunohistochemistry.Then,the prevalence of CD44+/CD24-cells in breast cancer tissue was calculated.Information was obtained regarding the relationship between this prevalence and distant metastasis.Results:Differences between the metastasis and control groups are significant in terms of the prevalence of CD44+/CD24-cells in breast cancer tissue(χ2=11.334,P＜0.05).The osseous metastasis group also deviated considerably from the control group in this respect(χ2=9.250,P=0.01).This prevalence is significant in five-year disease-free survival(χ2=8.058,P=0.005).Conclusion:The prevalence of CD44+/CD24-cells in breast cancer tissue is associated with distant metastasis,especially with osseous metastasis.

CD44+/CD24-cells,breast cancer stem cells,distant metastasis,osseous metastasis

10.3969/j.issn.1000-8179.20141554

①天津医科大学肿瘤医院乳腺二科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，乳腺癌防治教育部重点实验室（天津市300060）②湖北省宜昌市葛洲坝中心医院普外科

只向成 86496007@qq.com

王斌 专业方向为乳腺肿瘤临床治疗及基础研究。

E-mail：jeffrewang@hotmail.com