BRMS1和Cx43蛋白异常表达与甲状腺癌发生发展关系的研究*

吴宇 刘辉

·临床研究与应用·

BRMS1和Cx43蛋白异常表达与甲状腺癌发生发展关系的研究*

吴宇 刘辉

目的：探索甲状腺癌组织中乳腺癌转移抑制基因1（breast cancer metastasis suppressor 1，BRMSl）和细胞缝隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）的表达与患者临床资料、预后的关系。方法：收集2009年1月至2013年6月间福建省肿瘤医院头颈外科采用免疫组织化学SP法检测195例组织石蜡标本中BRMS1和Cx43蛋白表达情况，其中包括甲状腺癌90例，甲状腺腺瘤45例，结节性甲状腺肿和正常甲状腺组织各30例。结果：甲状腺癌组织中BRMS1和Cx43蛋白的阳性表达率分别为56.7%（51/90）和41.1%（37/ 90），均显著低于其他3组组织标本（均P＜0.001）。Cx43蛋白在不同病理类型组织中阳性表达率差异有统计学意义（均P＜0.05）：乳头状癌61.9%，髓样癌27.8%，滤泡状癌27.3%，未分化癌12.5%；而BRMS1的表达未见显著性差异。BRMS1和Cx43蛋白在淋巴结转移患者癌组织中表达率均显著低于无淋巴结转移患者（均P＜0.001）；亚组分析显示随着肿瘤TNM分期的改变，BRMS1和Cx43蛋白的阳性表达率逐渐下降，且两种蛋白表达呈正相关（r=0.494，P=0.032）。结论：BRMS1和Cx43蛋白在甲状腺癌组织中表达均显著下降，且其表达差异与甲状腺癌的浸润转移、肿瘤恶性程度及TNM分期有关，二者联合检测或有利于复发转移的判断。

甲状腺癌 乳腺癌转移抑制基因1 连接蛋白43 免疫组织化学

作为内分泌系统中常见的恶性肿瘤，甲状腺癌发病率表现出明显增高的趋势［1］。甲状腺癌的发生机制复杂，其转移也涉及多基因和蛋白的相互作用。因此，探索同甲状腺癌复发转移相关的蛋白，对于患者疗效评估和预后判断意义重大。近来诸多研究显示甲状腺癌细胞间通讯异常与甲状腺癌的转移关系极为密切，细胞缝隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）和乳腺癌转移抑制基因1（breast cancer metas﹣tasis suppressor 1，BRMSl）广泛参与调节肿瘤细胞的增殖和分化、恶性表型的进展及侵袭转移［2-3］。本研究采用免疫组织化学SP法检测BRMS1和Cx43蛋白在甲状腺癌组织中的表达情况，并分析其潜在的临床价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2009年1月至2013年6月间于福建省肿瘤医院行手术切除甲状腺石蜡组织标本195例，其中包括90例甲状腺癌，30例结节性甲状腺肿，45例甲状腺腺瘤，30例甲状腺正常组织（来源良性病变甲状腺次全切除的标本）。90例甲状腺癌中，男性38例，女性52例，平均年龄47（20～73）岁。组织标本收集前均未进行放化疗或免疫治疗等治疗手段，所有标本均为常规石蜡切片，经HE染色后由本院两位副高级职称以上病理科医生对组织进行病理分型：乳头状癌42例，滤泡癌22例，髓样癌18例，未分化癌8例。肿瘤分期依据国际抗癌协会联盟（UICC）2002年制定的TNM分期（Ⅰ～Ⅳ期病例数分别为13、28、31和18例）。本研究通过福建省肿瘤医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 试剂和方法 实验试剂主要为兔抗人BRMS1单克隆抗体和Cx43多克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司，BRMS1和Cx43工作液浓度均为1∶100。免疫组织化学SP试剂盒和DAB试剂盒均购自上海长岛生物公司。手术切除后的组织标本，先用10%中性福尔马林溶液固定，然后石蜡包埋。每例标本切片厚度约4 μm，采用SP法进行免疫组织化学染色（操作步骤参考试剂盒详细说明书），分为阴性和阳性对照：已知的乳腺癌阳性片作为阳性对照；PBS液代替一抗作为阴性对照组。

1.2.2 免疫组织化学判断标准 BRMS1和Cx43蛋白阳性细胞着色主要位于胞质或胞核内，显色呈淡黄色至棕黄色（染色深浅需要清除背景着色的影响）等。BRMS1和Cx43蛋白结果判断将结合染色强度评分和阳性细胞率：1）无着色（或基本不着色）、淡黄色、黄色及棕褐色分别记为0、1、2、3分；2）每张切片选择10个高倍视野（×400），各计数100个细胞，计算出阳性细胞表达的百分率（%），＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%以上为4分。免疫组织化学结果根据染色阳性细胞百分率和染色强度分别评分：0分为阴性（-）；1～2分为弱阳性（+），3～6分为中等阳性（++），＞6分为强阳性（+++）。染色强度与阳性细胞百分比的乘积＞1分计为免疫反应阳性（+）。免疫组织化学染色结果的鉴定均由本院两位病理科专业医师双盲阅片进行评分后进行统计（图1，2）。

图1 BRMS1免疫组织化学染色判断图谱Figure 1 Immunohistochemical staining for judging the BRMS1 map

图2 Cx43免疫组织化学染色Figure 2 Immunohistochemical staining of Cx43

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行实验数据分析。BRMS1蛋白表达阳性患者例数、Cx43蛋白表达阳性患者例数在不同组织中的比较为计数资料，组内及组间比较采取χ2检验。运用秩相关的Spearman方法分析BRMS1和Cx43蛋白表达的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BRMS1和Cx43蛋白在甲状腺癌、腺瘤、甲状腺肿及正常组织中的表达

免疫组织化学染色结果提示BRMS1和Cx43主要分布于胞质和胞核，呈弥漫性分布（表1）：BRMS1蛋白的表达在甲状腺癌组织、甲状腺腺瘤组织、结节性甲状腺肿组织及正常组织中均有显著性差异（χ2=32.191，P＜0.001）。在甲状腺癌组织中BRMS1蛋白的阳性表达率为56.7%（51/90），显著低于腺瘤（χ2=14.178，P＜0.001）、结节性甲状腺肿（χ2=10.989，P=0.001）和正常组织（χ2=16.200，P＜0.001）。Cx43蛋白的表达在甲状腺癌组织、甲状腺腺瘤组织、结节性甲状腺肿组织及正常组织中也均有显著性差异（χ2=58.658，P＜0.001），且Cx43蛋白在甲状腺癌组织中的阳性表达率为41.1%（37/90），同样显著低于腺瘤（χ2=21.815，P＜0.001）、结节性甲状腺肿（χ2=24.714，P＜0.001）和正常组织（χ2=31.642，P＜0.001，表1）。

2.2 甲状腺癌BRMS1和Cx43蛋白的表达与临床病理因素的关系

相比于无淋巴结转移的甲状腺癌患者，有淋巴结转移的癌组织中BRMS1、Cx43蛋白阳性表达率均显著下降（BRMS1：33.3%vs.77.1%；Cx43：26.2%vs. 54.2%），差异有统计学意义（均P＜0.001，表2）。Cx43蛋白在乳头状癌、髓样癌、滤泡状癌以及未分化癌组织中的表达率分别为61.9%、27.8%、27.3%和12.5%，差异有统计学意义（均P＜0.05），而BRMS1的表达在不同病理类型癌组织中却未见显著性差异。本研究同时发现肿瘤TNM分期和BRMS1蛋白间关系紧密，而与Cx43蛋白中关系不大。进一步亚组分析显示BRMS1的阳性表达率随着肿瘤TNM分期（Ⅰ～Ⅳ期）的提高有明显的下降趋势，而在Cx43蛋白中却未观察到这一趋势（表3）。

表1 BRMS1和Cx43蛋白在甲状腺癌、腺瘤、甲状腺肿及正常组织中的表达 例（%）Table 1 BRMS1 and Cx43 protein expression in thyroid carcinoma，adeno﹣ma，goiter，and normal tissues

2.3 BRMS1和Cx43蛋白表达的相关性分析

90例甲状腺癌患者中，BRMS1和Cx43蛋白表达均为阳性21例，均为阴性23例；BRMS1阳性但Cx43阴性30例，BRMS1阴性但Cx43阳性16例。Spearman相关性分析显示这两种蛋白表达呈正相关（r=0.494，P=0.032，表4）。

表2 BRMS1和Cx43蛋白表达与甲状腺癌临床病理因素的关系 例（%）Table 2 Relationship of the Cx43 and BRMS1 expression with clinicopathologic factors of thyroid cancer

表3 BRMS1和Cx43蛋白表达与肿瘤分期的关系Table 3 Relationship of the BRMS1 and Cx43 expression with tumor staging

表4 BRMS1和Cx43蛋白表达的相关性分析Table 4 Correlation analysis of BRMS1 and Cx43 expression

2.4 BRMS1和Cx43蛋白表达与肿瘤复发

90例甲状腺癌患者的随访采用电话随访或门诊随访，随访截至2015年3月（其中失访或临床资料不完整11例）。在完成随访的79例患者中，3年生存率为97.5%（77/79），无复发生存率为89.9%（71/79）。BRMS1蛋白阳性和阴性患者3年无复发生存率分别为100.0%（45/45）和76.5%（26/34）。Cx43蛋白阳性和阴性患者3年无复发生存率分别为90.6%（29/32）和89.4%（42/47）。复发的8例患者BRMS1蛋白全部阴性表达，而Cx43蛋白阳性、阴性表达的分别为3例和5例。

3 讨论

作为细胞间一种普遍存在的通讯方式，细胞缝隙连接（gap junction，GJ）广泛参与调节细胞增殖分化、凋亡及内环境的稳定等生物学行为。近年来新发现的Cx43是人体内重要的细胞缝隙连接蛋白，研究已证实许多恶性肿瘤的发生发展、浸润转移与Cx43基因表达异常所导致的细胞间隙连接通讯（gap junctional intercellular communication，GJIC）功能改变有关［4］。有研究［5］发现Cx43蛋白可作为乳腺癌早期诊断较好的标记物，其表达水平改变可反映乳腺恶性肿瘤的浸润进展。李国等［6］发现肺腺癌中Cx43蛋白和基因表达水平的差异与癌组织病理类型、淋巴结有无转移及肿瘤分期密切相关，可能是影响肺腺癌患者预后的重要分子指标之一。王化修等［7］发现Cx43在鼻咽癌的癌前病变组织中的表达明显下调。高飞等［8］同样发现骨肉瘤组织中Cx43蛋白的低表达。

甲状腺癌细胞的凋亡、迁徙转移等生物学特性和细胞间隙连接通讯关系密切。Jensen等［9］发现通过上调Cx43在甲状腺癌细胞中的表达，会显著提高该细胞对肿瘤坏死因子的反应性，从而促进癌细胞凋亡。Leithe等［10］认为甲状腺癌细胞逃避胸苷激酶介导的旁观者杀伤效应的分子机制与Cx43表达改变引起的GJIC受损有关。本研究通过免疫组织化学技术观察发现甲状腺癌组织中Cx43蛋白表达水平显著下降，且其表达差异同淋巴结有无转移及组织病理分型显著相关。同样观察到，不同病理类型的甲状腺癌组织中Cx43蛋白表达水平、强度差异一定程度上提示甲状腺癌中细胞缝隙连接通讯功能的下降，促进了异常的上皮细胞的增殖分化，使得细胞出现恶性表型，从而导致甲状腺癌的发生发展，甚至浸润转移。

影响恶性肿瘤细胞浸润转移的因素除了细胞缝隙连接蛋白表达改变之外，还与肿瘤转移相关基因的异常表达密切相关。BRMS1基因是最开始在研究乳腺癌的转移机制时发现［11］，近年研究提示该基因在存在转移的其他恶性肿瘤组织中也显著低表达或表达缺失，如前列腺癌［12］、胃癌［13］等。BRMS1抑制肿瘤转移的机制涉及多种途径，其中重要的途径之一为恢复细胞间缝隙连接通讯。Saunders等［14］通过上调BRMS1在具有转移潜能的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435发现，细胞连接蛋白Cx43表达水平也显著升高，细胞间的缝隙连接通讯恢复正常，从而使得乳腺癌细胞的表型趋向于正常乳腺组织。李晓瑜等［15］发现喉癌中Cx43下调的患者容易发生颈部淋巴结转移，或许与BRMS1抑制转移有关。

为验证甲状腺癌组织中Cx43蛋白的表达是否与BRMS1表达有一定的相关性，本研究同时检测了癌组织中BRMS1蛋白的表达。结果显示癌组织中BRMS1表达水平同样显著下降，表达差异与淋巴结转移和TNM分期等临床因素相关，结合患者的生存资料同样观察到BRMS1蛋白水平和甲状腺癌患者的复发转移间有一定的相关性。另外，本研究还观察到甲状腺癌组织中BRMS1和Cx43蛋白表达呈一定的正相关，或许提示其除在调节甲状腺癌细胞间缝隙连接及其恶性表型的转变中扮演重要角色外，同样共同参与和调节了癌细胞的浸润转移。目前鲜见对甲状腺癌组织中BRMS1和Cx43临床价值的研究，本研究为进一步明确甲状腺癌转移的分子机制及其后期患者诊治、预后判断提供了有力的依据。

综上所述，BRMS1和Cx43不仅参与甲状腺癌的发生发展，同样参与调节癌细胞转移的进程。联合检测甲状腺癌组织中这两种基因的表达水平有望成为甲状腺癌诊治新靶点及其预后判断的分子标记物。为进一步明确BRMS1和Cx43在甲状腺癌转移中的作用机制，本研究后期或将考虑从细胞层面对其进行验证。

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（2015-03-30收稿）

（2015-05-13修回）

（编辑：邢颖）

Abnormal expression of BRMS1 and Cx43 protein in thyroid cancer occurrence and progression

Yu WU,Hui LIU
Department of Head and Neck Surgery,Fujian Province Cancer Hospital,Teaching Hospital of Fujian Medical University. This work was supported by the Scientific Research Project of Fujian Provincial Health Bureau(No.2012-2-14).

Hui LIU;E-mail:279908653@qq.com

Objective:To investigate the protein expression levels of breast cancer metastasis suppressor 1(BRMS1)and Connexin 43(Cx43)in thyroid cancer and their correlation with clinicopathologic parameters.Methods:Immunohistochemistry Streptavidin-Peroxidase method was used to detect the BRMS1 and Cx43 protein expression in 195 tissue samples,including 90 cases with thyroid carcinoma,45 cases with thyroid adenoma,30 cases with nodular goiter,and 30 cases with normal thyroid glands.Results:The positive rates of BRMS1 and Cx43 expression was 56.7%(51/90)and 41.1%(37/90)in thyroid carcinoma,respectively,which are significantly lower than the rates in thyroid adenoma,nodular goiter,and normal thyroid gland tissues(P＜0.001).Of the three pathological types of thyroid cancer,the positive expression rate of Cx43 was 61.9%in papillary carcinoma,27.8%in medullary carcinoma,27.3% in follicular carcinoma,and 12.5%in undifferentiated carcinoma.Statistical differences in the BRMS1 expression among papillary carcinoma and the other pathological types were also noted.Unlike the patients without lymph node metastasis,the positive expression of BRMS1 and Cx43 proteins were both significantly low among patients suffering from nodal metastasis.Subgroup analysis shows that the positive expression of BRMS1 and Cx43 protein gradually decreased with TNM staging.In addition,a positive correlation was observed between the BRMS1 and Cx43 protein expression(r=0.494,P=0.032).Conclusion:The decreased expression of BRMS1 and Cx43 proteins is significantly correlated with the metastasis of thyroid cancer and malignant grade.The combined detection of the two proteins can be ideal biomarkers for judging the prognosis of thyroid carcinoma.

thyroid cancer,breast cancer metastasis suppressor 1,connexin 43,immunohistochemisty

10.3969/j.issn.1000-8179.20150322

福建医科大学教学医院，福建省肿瘤医院头颈外科（福州市350014）

*本文课题受福建省卫生厅青年科研计划（编号：2012-2-14）资助

刘辉 279908653@qq.com

吴宇 专业方向为头颈肿瘤外科治疗。

E-mail：429146964@qq.com