胃癌不同组织学分型与微血管密度及相关因子的关系*

吕靖芳 孙保存② 孙慧誌 张艳辉 孙俊英 赵秀兰② 古强②董学易② 车娜②

·临床研究与应用·

胃癌不同组织学分型与微血管密度及相关因子的关系*

吕靖芳①孙保存①②③孙慧誌①张艳辉③孙俊英①赵秀兰①②古强①②董学易①②车娜①②

目的：探讨微血管密度（microvascular density，MVD），基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管内皮生长因子受体1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）、血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）、p53蛋白与胃癌Lauren分型及WHO分型的关系。方法：收集89例胃癌患者的临床数据并将其按照Lauren和WHO标准进行分型。应用单克隆抗体CD34/PAS双重染色评价89例胃癌组织中的微血管密度，免疫组织化学法检测标本中MMP-2、MMP-9、VEGF、VEGFR1、VEGFR2和p53蛋白的表达。结果：在胃癌中，MVD与Lauren分型和WHO分型均无相关性（P＞0.05）。Lauren分型与MMP-9、VEGFR1和p53有相关性（P＜0.05），与MMP-2、VEGF和VEGFR2无相关性（P＞0.05）。WHO分型与各肿瘤相关因子均无相关性（P＞0.05）。Lauren分型和WHO分型是胃癌患者独立的预后因素（P＜0.05）。结论：对肿瘤相关因子、血管生成与胃癌发生、发展过程的研究，可能为不同组织学分型的胃癌患者提供新的治疗方法。

胃癌 Lauren分型 WHO分型 微血管密度 p53MMP-2MMP-9VEGFVEGFR

胃癌是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一，占肿瘤发生率的8%，肿瘤死亡率约10%，超过70%的新发和死亡病例出现在发展中国家［1］。胃癌的确诊依赖于组织学分型，但现存的标准争议较大。

WHO分型将胃癌主要分为管状腺癌、乳头状癌、黏液腺癌和印戒细胞癌。Lauren［2］将胃癌分为三型：肠型、弥漫型和混合型，以前两型为主。许多研究［2-4］发现胃癌不同组织学分型预后不同。本研究探讨不同组织学分型的MVD差异并通过检测p53、MMP-2、MMP-9、VEGF、VEGFR1和VEGFR2的表达，探讨肿瘤相关因子在胃癌发生中的作用，为胃癌不同分型给予个体化治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例资料 经研究对象或其家属知情同意，收集2004年3月至2007年11月于天津医科大学肿瘤医院手术切除的89例胃癌标本。全部标本经10%中性福尔马林固定、常规石蜡包埋，在显微镜下观察H&E染色切片，选取典型肿瘤组织区域并4 μm连续切片备用。其中WHO分型中管状腺癌51例，乳头状癌24例，黏液腺癌11例，印戒细胞癌3例。Lauren分型中肠型44例，弥漫型45例。所有患者术前均未行放疗、化疗及免疫治疗。随访截止至2013年6月。生存期为诊断当日到患者死亡或随访截止日之间的时间。

1.1.2 主要试剂 VEGF鼠抗人单克隆抗体（ZM-0265）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，浓度为1∶50；VEGFR1兔抗人单克隆抗体（ab-32152）购自美国Abcam公司，浓度为1∶250；VEGFR2兔抗人多克隆抗体（RB-1526-P0）购自美国Thermo公司，浓度为1∶50；MMP-2兔抗人多克隆抗体（10373-2-AP）购自美国Proteintech公司，浓度为1∶400；MMP-9鼠抗人单克隆抗体（MAB-0245）购自福州迈新生物技术有限公司，即用型；p53鼠抗人单克隆抗体（MAB-0142）购自福州迈新生物技术有限公司，即用型；CD34为鼠抗人单克隆抗体（ZM-0046）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，浓度为1∶550；羊抗兔、羊抗鼠试剂盒（PV-6001，PV-6002）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB酶底物显色试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。0.5%过碘酸和Schiff试剂由天津医科大学病理教研室配置。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 石蜡切片常规脱蜡水化，蒸馏水冲洗，枸橼酸缓冲液（pH=6.0）高压修复，冷却至室温后蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，加非免疫动物血清封闭30 min，除去非免疫动物血清，加适量一抗，4℃冰箱过夜，次日恢复室温1 h后，PBS冲洗后每张切片加适量二抗，室温下孵育90 min，PBS冲洗后DAB显色，显微镜下观察，持续5～10 min，自来水冲洗后苏木素复染，常规梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.2 CD34/PAS双染 石蜡切片脱蜡水化，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，枸橼酸缓冲液（pH=6.0）高压抗原修复2.5 min，3%H2O2消除内源性过氧化物酶15 min，蒸馏水冲洗，PBS冲洗后滴加一抗，4℃孵育过夜。次日PBS冲洗，滴加鼠二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗后，DAB镜下显色后将切片置于0.5%过碘酸溶液中常温孵育10 min，蒸馏水浸洗5遍，滴加Schiff试剂，37℃孵育15～30 min。流水冲洗，苏木素复染细胞核，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

1.2.3 对照实验 在每次染色流程中均按染色质量控制标准设有对照。阳性对照为阳性MMP-2、MMP-9、VEGF乳腺癌切片，阳性VEGFR2血管肉瘤切片，阳性VEGFR1、p53肠癌切片。阴性对照为PBS代替一抗。

1.2.4 免疫组织化学半定量标准 采用Mattern等［5］积分法，即分别评估该蛋白免疫染色的强度和范围，并将每种评估内容均分成4个等级。染色强度积分：0为阴性；1为浅黄色；2为深黄色；3为棕黄色。标本选择5个含有阳性细胞的高倍视野（×400），分别计数100个肿瘤细胞，取其平均值计数阳性细胞百分率。0为阳性细胞≤10%；1为阳性细胞≤30%；2为阳性细胞≤70%；3为阳性细胞＞70%。上述两个独立的评分相乘作为染色指数：0分为（-），1～3分为（+），4～6分为（++），7～9分为（+++）。（-）为低表达，（+）、（++）和（+++）为过度表达。

1.2.5 MVD计数方法 按文献［6］判断阳性结果，先在低倍镜下（×100）寻找肿瘤内血管密度最高区，然后在高倍镜下（×400）计数5个血管最高密度区的微血管数，其均值代表MVD。在肿瘤区域凡是染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇，与邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，作为一个血管计数。管腔直径＞8个红细胞或管壁有明显肌层以及纤维硬化、炎症及坏死的微血管均不计入总数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，单因素和多因素生存分析采用回归分析法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MVD与胃癌不同组织学分型的关系

MVD与Lauren分型（P=0.604）、WHO分型（P=0.213）均无相关性（表1）。

2.2 肿瘤相关因子与胃癌组织学分型的关系

p53蛋白染色主要定位于胃癌细胞胞核，MMP-2、MMP-9、VEGF主要表达在肿瘤细胞胞浆和细胞膜，VEGFR1和VEGFR2主要位于肿瘤细胞的细胞浆和细胞膜，少数表达于基质血管中（图1、2）。其与Lauren分型和WHO分型的关系见表2和表3。p53（P=0.042），MMP-9（P=0.020）和VEGFR1（P=0.044）与Lauren分型有关。各肿瘤相关因子与WHO分型均无相关性（P＞0.05）。

2.3 单因素分析及多因素分析

Cox单因素及多因素（表4）分析可知，对于患者总生存时间，Lauren分型（P=0.003）和WHO分型（P=0.004）均可以作为独立的预后因素。

表1 胃癌病理分型与MVD的关系 x±sTable 1 Relationship between different pathological classifications and microvascular density in gastric cancer x±s

图1 胃癌组织中微血管表达（CD34/PAS×400）Figure 1 Expression levels of microvessel density in gastric cancer（CD34/PAS×400）

表2 Lauren分型与不同肿瘤相关因子的关系Table 2 Relationship between Lauren classification and different molecular factors

图2 p53、MMP-2、MMP-9、VEGF、VEGFR1和VEGFR2在胃癌中的表达（S-P×400）Figure 2 Expression of p53,MMP-2,MMP-9,VEGF,VEGFR1,and VEGFR2 in gastriccancer（S-P×400）

表3 WHO分型与不同血管生成相关因子的关系Table 3 Relationship between WHO classification and different molecular factors

表4 患者临床特征与总生存时间的Cox单因素及多因素分析Table 4 Univariate and multivariate analyses of the prognostic factors of overall survival

3 讨论

相对于西方国家，亚洲胃癌患者预后更差。我国每年约有30万新发病例，近24.4万人死于胃癌。目前，我国常用的组织学分型为Lauren分型和WHO分型［7］。本研究探讨胃癌中新生血管及肿瘤相关基因与不同分型的关系，寻找胃癌不同组织学分型形成的可能的途径，为临床进行针对性治疗提供理论依据。

Lauren［2］于1965年提出Lauren分型，将胃癌分为肠型、弥漫型和混合型。前两者无论在整体结构或细胞结构上均存在差异。肠型胃癌是胃黏膜对环境因素或者Hp感染产生的一系列变化，从慢性胃炎、胃萎缩、肠化生到早期癌、浸润癌以及远处转移［8］；呈高分化，多存在大管腔结构，伴乳头形成；肿瘤细胞大且结构清晰，形态学上差异性大。弥漫型胃癌主要起源于非萎缩型胃炎，分化程度较差，少有腺体形成；细胞质松散，细胞形态单一。混合型兼具上述二者的特点。研究［2-4］指出Lauren分型对患者预后有指导意义，本研究中的多因素分析也认为其是胃癌独立的预后因素（P=0.003），相比较弥漫型，肠型胃癌患者预后好。

世界卫生组织修订的胃癌WHO分型是目前应用最广泛的分型方法。常见类型包括管状腺癌、乳头状腺癌、黏液腺癌和印戒细胞癌。管状腺癌的特点是肿瘤主要由管腔构成。乳头状腺癌指癌组织形成腔隙，并且形成的乳头向腔内突出。黏液腺癌指大量分泌的黏液堆积在腺腔内。印戒细胞癌的特点是胃癌弥漫浸润性生长，肿瘤细胞的细胞核被胞浆内的黏液挤到细胞的一侧，呈印戒状。多因素分析显示WHO分型也是胃癌独立的预后因素（P=0.004），印戒细胞癌预后最差。

微血管密度是近年来的研究热点，是反映肿瘤血管生成的重要指标。许多研究发现其高表达有助于肿瘤细胞适应机体内环境的变化而更宜增殖、浸润和转移［9-10］。

本研究中MVD与Lauren分型无相关性（P=0.604），弥漫型胃癌MVD值略高于肠型。其他研究也认为弥漫型胃癌中MVD值更高［11］，且差异有统计学意义，原因为弥漫型较肠型胃癌生长快、预后差［2］，这可能与其新生血管活性高，为肿瘤提供了养分和转移通道有关。而Takahashi等［12］结论为肠型胃癌中MVD值更高，原因为发现部分正性血管生成因子在肠型胃癌中表达更高，促进了血管生成。本研究认为肿瘤有三种血管生成模式：内皮依赖性血管、马赛克血管和血管生成拟态。而MVD主要代表内皮依赖性血管，弥漫型胃癌的不良预后可能与马赛克血管和血管生成拟态更密切相关。本研究发现MVD与胃癌WHO分型无相关性（P=0.213），与部分相关报道［13-14］一致。

在众多参与肿瘤血管生成的因子中，VEGF被认为是中心调节因子［15］，与多种信号通路相关。VEGF需要与受体识别结合发挥生物学作用，其中VEGFR2被认为是肿瘤新生血管的主要介导因子，而VEGFR1对恶性肿瘤生长具有更直接的作用［16］。本研究发现仅VEGFR1与Lauren分型有关（P=0.044），VEGF和VEGFR2均无统计学相关性。有研究也发现VEGF在弥漫型胃癌中表达率更高［11，17］，与本实验结果完全一致。VEGF及其受体与WHO分型均无相关性，与张君红等［14］研究一致。各项研究显示胃癌的不同组织学分型与肿瘤新生血管和血管形成相关因子之间的关系尚不确定。这可能与样本量的大小、检测方法及评分标准不同有关。

p53基因分为野生型和突变型。野生型p53是迄今为止发现的与人类肿瘤关系最密切的抑癌基因［18］，是抗肿瘤生长、转移相关的重要蛋白。当其突变时则失去了对细胞生长、凋亡、DNA修复的调控，易引起细胞癌变［19］。目前免疫组织化学测出的p53蛋白几乎都为突变型［20-23］。本研究发现p53在肠型胃癌中的表达明显高于弥漫型（50.0%vs.28.9%，P=0.042），与相关研究［24-26］一致。但p53与WHO分型无明显相关性（P=0.231）。

肿瘤生长代谢的重要步骤是细胞外基质的降解、肿瘤细胞突破基底膜，转移到其他部位［27］。MMPs是一类水解细胞外基质的蛋白裂解酶家族，与恶性肿瘤的不良预后有关［28］。MMP-2和MMP-9是其中最重要的两种，均属Ⅳ型胶原酶，能够降解细胞外基质和基膜中的Ⅳ型胶原。本研究发现MMP-9在肠型胃癌中阳性率更高，差异具有统计学意义，而MMP-2无相关性。这可能因为MMP-9降解胶原的能力是MMP-2的25倍［29］，所以其更具代表性。二者与WHO分型无相关性。相关性的不同可以因样本数量、环境或者基因型的差异来解释［30］。此外，方法和技术如样本的包埋时间，不同厂家生产抗体的敏感性、特异性，以及计数标准不同均有可能影响结果［31］。

综上所述，随着对肿瘤相关因子、血管生成以及胃癌发生、发展和转移过程的深入研究可能为不同分型的胃癌患者提供新的治疗方法。

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（2015-04-14收稿）

（2015-07-20修回）

（编辑：郑莉）

Relationship of different histological classifications of
gastric cancer with microvessel density and related factors

Jingfang LV1,Baocun SUN1,2,3,Huizhi SUN1,Yanhui ZHANG3,Junying SUN1,Xiulan ZHAO1,2,Qiang GU1,2,Xueyi DONG1,2, Na CHE1,2

1Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2Department of Pathology,General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China;3Department of Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China.
This work was supported by the Key Project of National Natural Science Foundation of China(No.81230050),the National Natural Science Foundation of China(No.81172046 and 81173091),and the Innovation and Entrepreneurship Training System(No. 201210062001).

Objective:To investigate the correlations of Lauren classification and world health organization(WHO)classification of gastric cancer(GC)with microvascular density(MVD),matrix metalloproteinase-2(MMP-2),matrix metalloproteinase-9(MMP-9),vascular endothelial growth factor(VEGF),vascular endothelial growth factor receptor 1(VEGFR1),vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2),and p53.Methods:The clinical data of 89 patients with GC were collected.The collected specimens were categorized on the basis of Lauren classification and WHO classification.CD34/periodic acid-Schiff(PAS)double staining was performed to validate MVD. Immunohistochemistry was conducted to investigate the expression levels of MMP-2,MMP-9,VEGF,VEGFR1,VEGFR2,and p53.Results: MVD was not correlated with Lauren classification or WHO classification(P＞0.05).Lauren typing was associated with the expression levels of MMP-9,VEGFR1,and p53(P＜0.05).WHO classification was not related to any of the factors(P＞0.05).Cox proportional hazards model revealed that Lauren classification and WHO classification were the prognostic factors of overall survival(P＜0.05).Conclusion:This research on tumor related factors,angiogenesis,and different classifications of GC may provide new methods to treat this disease.

gastric cancer,Lauren classification,WHO classification,MVD,p53,MMP-2,MMP-9,VEGF,VEGFR

10.3969/j.issn.1000-8179.20150394

①天津医科大学病理教研室（天津市300070）；②天津医科大学总医院病理科；③天津医科大学附属肿瘤医院病理科

*本文课题受国家自然科学基金重点项目（编号：81230050），国家自然科学基金（编号：81172046，81173091）和国家级大学生创新创业训练计划（编号：201210062001）资助

孙保存 baocunsun@aliyun.com

吕靖芳 专业方向为临床病理学。

E-mail：tjlvjingfang@163.com