神经干细胞移植减轻ICH模型大鼠的神经功能障碍

祁 景 刘小军 周明锴

郑州大学第二附属医院ICU 郑州 450014

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一种严重威胁人类健康的重大疾病［1］。本实验从细胞替代、旁分泌脑源性生长因子和促进突触再生的角度，探讨神经干细胞（neural sfem celle，NSCS）移植改善脑出血大鼠神经功能的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组及模型制作 动物的饲养和后续所有相关实验程序均经郑州大学伦理委员会批准。SD大鼠由河南省动物中心提供。随机选取雄性SD大鼠30只，分为3组：sham组（采用立体定位仪定位穿刺但不打入胶原酶）10只，ICH模型组（模型组，采用立体定位仪定位穿刺并打入胶原酶并鉴定合格）10只，NSCS细胞干预组（NSCS组，采用立体定位仪定位穿刺并鉴定合格后注射NSCS 1×106）10只，参照文献［2］及George Paxinos大鼠脑立体定位图谱，将大鼠取俯卧位，采用固定器，固定在大鼠脑立体定位仪上，以左侧纹状体为穿刺点（前囟后0.2mm，左侧旁3mm，垂直6 mm）。采用10μL微量进样器，在该穿刺点缓慢注入0.5μLⅦ型胶原酶溶液（sigma公司），留针约10min后缓慢退出穿刺针。术后清洁创面，缝合头皮。术后24h内进行mNSS评分［3］，选取8～12分为符合标准纳入分组内。

1.2 NSCS的培养 复苏NSCS（本实验室保存），给复苏的NSCS每天更换细胞培养基（DMEM／F12，20%KSR，1mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ巯基乙醇，0.1mM NEAA，10ng／mL bFGF），长至可以传代。

1.3 神经功能评分 采用mNSS评分（包括运动、感觉、平衡、反射）评价大鼠神经功能缺损和恢复情况，各组均在术后1、3、7、14、28d评分。

1.4 脑组织取材 造模后28d提取各组大鼠脑组织标本，3～5只多聚甲醛灌注固定法固定脑组织，梯度蔗糖脱水后冰冻冠状切片（厚12μm）。

1.5 免疫组织化学染色 各组切片做brdu（抗体均购自santa，一抗为鼠抗人，二抗为兔抗鼠）的免疫荧光染色，和BDNF和GAP-43（抗体均购自santa，一抗为兔抗鼠，二抗为山羊抗兔）的免疫组织化学染色。免疫组化采用imageJ进行阳性信号灰度值的测定分析。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，其中mNSS数据行重复测量分析，其余资料行单因素方差分析并行组间两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 各组各时间点mNSS评分结果，第14天起，各时间点NSCS组的评分明显优于模型组、假手术组（P＜0.05）

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 立体定向注射胶原酶诱导大鼠脑出血后，大鼠迅速出现出血、对侧偏瘫等神经功能缺损的表现，症状体征于术后1～3d达高峰，随后逐渐恢复。NSCS组较模型组后14d及28d的mNSS评分且差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 Brdu免疫荧光染色 荧光显微镜下可见Brdu免疫荧光染色阳性的细胞明显聚集分布于血肿周围，血肿对侧仅可见少量阳性细胞散在分布。见图2。

图2 绿色免疫染色为阳性，A为血肿周围，B为血肿对侧脑区（200×）

2.3 BDNF表达上升 BDNF在3组中均有表达，且在血肿周围的表达量较高。免疫组化阳性细胞胞浆被染为棕褐色或棕黄色颗粒状，阴性者除细胞核染成蓝色外，无棕黄色反应物。BDNF在假手术组，模型组仅可见少量阳性细胞，NSCS组较两者增多。结果显示，NSCS组高于组模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

2.4 GAP-43表达上升 GAP-43在各组中也均有表达，GAP-43在NSCS组较假手术组与模型组表达增多见图4。结果显示NSCS组与假手术组的阳性细胞数差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

脑出血引起的神经功能障碍，严重威胁人类健康和影响生活质量。随着干细胞技术的发展，干细胞其衍生物成为人类神经系统难治性疾病——脑出血富有应用前景的治疗选择之一［4］。

本实验NSCS干预组第14天及第28天其神经功能评分显著优于模型组。从行为学上表明NSCS移植在脑出血模型中具有确实的治疗作用。

BDNF是一类多功能的多肽生长因子，具有调节神经元的存活、分化，以及轴突导向和突触的功能［5］。BDNF激活高亲和力受体TrkB后有助于神经存活，还具有调节突触的结构和数量、促进新形成突触的发育和成熟、促进树突棘和轴突的生长等作用。我们通过免疫组织化学染色的方法检测到BDNF分泌增多，证实了NSCS分化的细胞具有促进旁分泌的功能。本实验通过立体定位向ICH大鼠移植NSCS，NSCS可促进BDNF的表达增多。

GAP-43是一种广泛分布在神经系统中的胞膜磷酸蛋白质［6］。GAP-43是可以促进神经元发育和再生的一个重要的内在决定因子，它是由神经元包体合成，与神经轴突的生长密切相关，在神经元发育和再生过程中，作为神经元的损伤、修复及再生的重要分子标志物，随着神经轴突的生长大量合成［7］。BDNF能够促进轴突生长锥表面GAP-43和轴突骨架蛋白β-tublin表达的上调从而促进轴突的延伸［8］。

本实验进一步证实，NSCS的移植能够改善局部的微环境、上调BDNF并启动再生相关GAP-43的表达增多，进而促进脑出血后神经功能的恢复。总之，我们以脑出血模型大鼠为研究对象，采用ICH患者来源的NSCS进行移植治疗。结果表明NSCS移植能有效改善ICH模型大鼠的神经功能障碍，其机制为细胞替代、旁分泌神经营养因子和促进轴突再生等多个方面。

图3 BDNF免疫组化染色，A假手术组，B模型组，NSCS组（400×）

图4 GAP-43免疫组化染色，A假手术组，B模型组，NSCS组（400×）

图5 BDNF及GAP-43免疫组化的灰度值，各组均为阳性，但NSCS组较假手术组、模型组灰度值均增多（P＜0.05）

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