微小电极测定植物油过氧化值准确度评价

陶 莎 王 玮 陈复生 张 惠 薛文通

（中国农业大学食品科学与营养工程学院1，北京 100083）

（石家庄市农林科学研究院2，石家庄 050041）

（河南工业大学粮油食品学院3，郑州 450001）

微小电极测定植物油过氧化值准确度评价

陶 莎1王 玮2陈复生3张 惠1薛文通1

（中国农业大学食品科学与营养工程学院1，北京 100083）

（石家庄市农林科学研究院2，石家庄 050041）

（河南工业大学粮油食品学院3，郑州 450001）

研究设计了一种检测过氧化值的新方法，即采用壳聚糖修饰丝网印刷电极经微分脉冲溶出伏安法扫描，来取代碘量法中人工滴定确定碘离子浓度变化的步骤。采用该方法对40种市售植物油的过氧化值进行测定，并与国标法（GB／T 5538—2005）的测定结果进行比对，综合偏离度与En数2项指标进行评价，结果表明：2种方法在定性判定方面结果一致，而在定量判断方面有37个结果满意，整体满意率为92.5%，其中0.016～0.075 mmol／kg区间内的结果更为准确，满意率为91.6%。研究表明，与国标法相比，新方法在操作性、安全性等方面存在一定优势，在一定过氧化值范围内，结果准确性能够得到认可。

En数 偏离度 不确定度评价 微小电极 过氧化值 植物油

过氧化物在化学、医药、生物、食品、环境等领域广泛存在，过氧化氢及其他有机过氧化物对人体具有严重的危害，主要表现为：进入人体内转化为过氧化自由基，可激活酪氨酸氧化酶或直接催化酪氨酸产生黑色素，加速机体的衰老；自由基可通过损伤DNA导致肿瘤的发生，可导致血脂增高，血管内壁增厚，最终导致动脉粥样硬化的发生［1-3］，因此准确、快速测定食品、环境、医药中的过氧化物含量水平具有重要的现实意义。

目前碘量法是油脂过氧化值测定的常用方法，该法简单易行，但存在测定过程耗时长，所需化学试剂多，对深色油脂测定时滴定终点难判断等缺点。通过调研市场现有的植物油品质快速检测仪器，发现大多存在定性、定量准确度不高；检测结果无法与国标中规定的结果换算；仪器尺寸较大、便携性差；需购买配套试剂、成本较高等问题。

随着科技的发展，事物都呈现小型化发展趋势，电极也不例外。以往认为当电极面积变小时，会影响测量精度，但经过长期研究发现，微小电极具有普通电极所没有的独特优点［4］，现已成功应用于高分子化学、光电化学、生物化学、流动分析技术等领域。其中在生化方面最常见的是采用超微小电极测定细胞内氧浓度［5］以及采用碳纤维电极监测神经细胞附近多巴胺的分泌［6］；在流动分析技术中，采用微小电极能够分析的物质包括：儿茶酚胺、吲哚胺、羟色胺类物质、碳水化合物、氨基酸、酚类物质等［7-10］。本试验借鉴血糖仪试条的样式，开发了一种丝网印刷电极，用以检测植物油的过氧化值。通过测定40种不同过氧化值的植物油样品，采用比率值En数［11］与偏离度2项指标进行方法学比较，评价该方法准确度。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

过氧化月桂酰（95%）：美国Fluka公司；壳聚糖（92%）：北京拜尔迪生物公司；柠檬酸、柠檬酸钠、碘化钾、硫代硫酸钠、可溶性淀粉、水杨酸、冰乙酸、异辛烷、正己烷：均为分析纯，北京化学试剂公司；植物油样品：通过海淀区产品质量监督检验所从北京市内市场、工厂、餐饮店等收集得到过氧化值各异的40个植物油样品。

1.2 仪器与设备

CHI650C电化学工作站：上海辰华仪器公司；AC1·W4·R1丝网印刷电极（图1）：上海易达科技术有限公司；微量移液器：Finnpipette雷勃；GL3250A磁力搅拌器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

图1 测定过氧化值用丝网印刷三电极系统

1.3 试验方法

1.3.1 壳聚糖修饰丝网印刷电极法测定过氧化值的原理［12］

壳聚糖分子中的-NH2在酸性溶液中质子化为-NH+3，对碘离子等阴离子有静电引力作用，但不能吸附游离碘。使用壳聚糖修饰丝网印刷电极，在含有碘化钾的电解液中进行吸附溶出伏安扫描，可在0.8 V附近产生一个峰形良好的氧化峰（图2①）；但是当溶液中有过氧化物存在时，过氧化物能够将碘离子氧化生成游离碘，此时溶液中的碘离子浓度下降，而壳聚糖修饰电极不能吸附游离碘，产生的峰电流值会明显下降（图2②），而峰电流值的变化与溶液中过氧化物的含量存在一定的比例关系。本研究利用这种原理设计开发了用于植物油过氧化值检测的电极，对其进行准确度评价。

图2 添加过氧化物对壳聚糖修饰电极检测碘离子的影响

1.3.2 壳聚糖修饰丝网印刷电极的制备

准确称量壳聚糖50 mg，加入2 mol／L的乙酸水溶液5 mL，超声搅拌使其溶解并去除溶液中的氧气。之后用移液器吸取2.0μL，采用旋涂法使其在工作电极表面形成厚度均一的壳聚糖膜，4℃保存备用。

1.3.3 碘量法

参照GB／T 5538—2005标准。

1.3.4 标准加入法

精确称取过氧化月桂酰400 mg，用正丙醇定容至100 mL，之后用移液管移取1.00 mL，再次用正丙醇定容至1 000 mL，作为标准贮备液备用，此时过氧化月桂酰质量浓度为4μg／mL。再按照表1配制不同浓度的过氧化月桂酰标准工作液。

表1 不同过氧化月桂酰浓度配制方法

接着向5组过氧化月桂酰标准工作液中加入0.5 mL饱和碘化钾水溶液，混合均匀后室温下避光反应3 min。之后将壳聚糖修饰丝网印刷电极插入待测液体中，室温下边搅拌边进行电化学富集，接着停止搅拌，静置一定时间，之后改变电极电位，从低电位方向向高电位方向进行微分脉冲伏安法扫描，记录电流-电位曲线，得到峰电流值（Ip）。以过氧化物浓度为横坐标，Ip为纵坐标绘制标准曲线。其中电化学测定参数分别为：富集电位0.8 V，富集时间45 s，静止电位0.1 V，静止时间25 s；微分脉冲伏安法的脉冲条件为：开始电位0.1 V，终止电位1.5 V，电位增量0.004 V，振幅0.05 V，脉冲宽度0.1 s，脉冲周期0.2 s。

1.3.5 植物油样品的处理

称取植物油样品1.00 g，于25 mL容量瓶中，用正丙醇与0.1 mol／L柠檬酸 -柠檬酸钠缓冲溶液（pH 5.0）的混合液（体积比为1∶4）定容。接着按与绘制标准曲线相同的方法，加入饱和碘化钾水溶液0.5 mL，室温下避光反应3 min。之后采用微分脉冲吸附溶出伏安法进行电化学分析，得到峰电流值。根据标准曲线由峰电流值计算得到样品中过氧化物的含量，之后根据式（1）算出植物油样品的过氧化值，即为新法的测定值。

式中：P为植物油过氧化值／mmol／kg；C为过氧化物浓度／μg／mL；V为加入的正丙醇与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的体积／mL（本试验中为25 mL）；w为样品称样量／g；a为换算系数（参见表2）。

表2 油脂的过氧化值的表示方法与换算系数［13］

1.3.6 数据分析方法

采用偏离度和比率值En数2项指标来对食用植物油快速检测方法和快速检测设备的结果准确度进行评价。

1.3.6.1 偏离度

按式（2）计算，综合新方法的精密度，选取20%为临界点，即｜偏离度｜＞20%时结果判为不满意，｜偏离度｜≤20%时判为满意。

式中：Xlab为新方法检测值／mmol／kg；Xref为国标法检测值／mmol／kg。

1.3.6.2 比率值En数

试验操作中，往往有一些不确定的误差来源，它将引起结果的不确定性。为全面评价准确度，增加了由于方法不确定度引起的误差评价。本试验中通过比率值En数（公式3）评价方法不确定度对比对结果的影响。比率值En通常用于实验室能力比对验证，设定一个参考实验室，由参考实验室校准参加实验室结果的准确度。｜En｜＞1时结果判为不满意，｜En｜≤1时结果判为满意。

式中：Xlab为新方法检测值／mmol／kg；Xref为国标法检测值／mmol／kg；μlab为新方法的不确定度；μref为国标法的不确定度。

1.3.6.3 方法准确度判定评价原则

在本次方法评价中采用偏离度与En数对快速检测方法及设备的结果准确度进行综合评价判定，判定原则如下：

偏离度≤20%时，该检测结果为满意；偏离度＞20%，且｜En｜≤1时，该检测结果为满意；偏离度＞20%，且｜En｜＞1时，该检测结果为不满意。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖修饰丝网印刷电极对脂质过氧化物的电流响应与浓度的关系

采用标准加入法配制一系列不同浓度过氧化月桂酰溶液样品，采用微分脉冲吸附溶出伏安法，记录微分脉冲伏安曲线，同浓度样品做3次平行试验，取其峰电流值的平均值为纵坐标，以过氧化物含量为横坐标，绘制过氧化月桂酰电流响应值与其浓度之间的校正曲线。并建立数学模型。

壳聚糖修饰电极法测定过氧化值，其实质是测定被过氧化物氧化后溶液中残留碘离子的量。因此当过氧化值较低时，溶液中残留的碘离子量较大，而电极表面的壳聚糖膜吸附碘离子的能力有限。因此峰电流值随着过氧化值的降低而增长缓慢。因此建立的数学模型虽然在 0.012 8～0.08、0.08～0.8、0.8～3.2 μg／mL 3个区间内分别呈线性相关关系（相关系数R分别为0.998 0、0.996 8、0.999 2），但在整体浓度范围内偏向于对数关系（图3，R＝0.993 5），可用式（4）表述。

式中：c为过氧化物质量浓度／μg／mL；ip为峰电流值（10-5A）。

图3 壳聚糖修饰电极对过氧化月桂酰的催化响应电流与浓度间的校正曲线

2.2 偏离度

取40个植物油样品，过氧化值范围为0.014～0.19 mmol／kg。根据 GB 2716—2005《食用植物油卫生标准》［14］对食用油中过氧化值的限量要求，分别利用壳聚糖修饰电极法与国标法（GB／T 5538—2005）对检测样品进行定性判定，利用偏离度进行定量判定，见表3，图4。

通过比对试验测定40个植物油样品，在定性评价中结果全部一致，判定为满意结果。在定量判定中发现有25个样品的偏离度的绝对值在20%以下，视为满意结果，见表4。

表3 采用偏离度比对壳聚糖修饰电极法与国标法的结果

图4 壳聚糖修饰电极法与国标法比对偏离度分布

表4 偏离度分布统计

40个样品的偏离度分布区间为-36.36%～178.69%，且有7个检测值的偏离度为0。检测值在0.048～0.075 mmol／kg区间内准确率较高，可达到93.3%，该范围处于标准曲线最大值的2／5～3／5的位置，也是通常准确性最高的位置。检测结果表明，新方法检测值较低时偏差百分率普遍偏大，随着检测值增大逐渐减小并趋于稳定。检测结果的偏差可能是由于方法的不确定度产生，因此利用比率值En对不满意的15个比对结果进行二次判定。

2.3 不确定度评价

比率值En数的计算应以国标法和比对方法的方法不确定度为基础，因此在进行En数评价以前需要确定每次检测所产生的不确定度［15］。首先，通过对新方法检测步骤的分析，确定其不确定度来源，壳聚糖修饰电极法的不确定度要因如图5所示。之后，根据因果图，对各项不确定度进行计算。由于样品数量较多，因此仅以其中1个样品为例，说明各项不确定度的计算依据。

图5 不确定度因果图

2.3.1 样品平行测定产生的不确定度μ

单个样品检测为例，做5个平行检测，检测结果如表5所示。

表5 平行检测结果

样品平行测定导致的标准不确定度＝标准差／n0.5＝0.049 95，则相对标准不确定度μa＝标准不确定度／均值 ＝0.049 95／3.761＝0.013 3。

2.3.2 标准曲线产生的不确定度μ2

电极法检测植物油过氧化值模型构建过程中，过氧化物含量（以过氧化月桂酰标记）与峰电流值的相关关系为：Ip＝-0.58ln c+2.391，R＝0.993 5。为评定线性拟合引起的不确定度，选用以下8个标准液浓度，每个浓度做3个平行，3个平行的平均试验结果如表6所示。

表6 过氧化月桂酰标准溶液浓度平均值与相应峰电流值

对同一浓度的样品液测定3次，将所得的响应峰电流值取平均值，根据方程求该样品的过氧化物浓度c样液＝3.16μg／mL，则根据标准曲线求样液浓度时产生的标准不确定度按式（5）计算：

式中：μ样液为根据标准曲线求样液浓度时产生的标准不确定度；SIp／c为根据标准曲线求得的峰电流值与相应的峰电流值得回归剩余标准差；m为样品溶液测定总次数，m＝3；n为标准样品测定总次数，n＝24；c样液为样品液根据标准曲线求得的过氧化物浓度／μg／mL；c为样品液过氧化物质量浓度／μg／mL；ci为各标准溶液根据标准曲线求得的过氧化物质量浓度／μg／mL；ci为各标准溶液过氧化物质量浓度／μg／mL；ip为标准溶液各峰面积测定值／10-标准溶液各峰面积的回归值／10-5A。

经计算，根据标准曲线求样液浓度时产生的标准不确定度μ样液为0.033，则标准曲线产生的不确定度 μ2＝μ样液／C样液＝0.033／3.16＝0.010 4。

2.3.3 回收率产生的不确定度μ3

为验证壳聚糖修饰电极法测定植物油过氧化值的准确度。采用相同方法同时测定花生油、大豆油、橄榄油和葵花籽油（4种油均购于超市）过氧化值。向待测植物油中添加2.4μg／g的过氧化月桂酰进行添加回收率试验，每个添加浓度重复3次，结果如表7所示。经计算，4种植物油的平均回收率＝99.95，标准偏差S＝2.215，标准不确定度＝S／40.5＝1.108，则相对不确定度 μ3＝1.108／99.95＝0.011 1。

表7 加标回收率试验

2.3.4 称量产生的不确定度μ4

待测植物油和化学试剂的称量过程引入的不确定度由电子天平的标准不确定度造成。天平检定证书中要求电子天平的最大允许误差为±0.1 mg，按均匀分布，标准不确定度＝0.1／30.5＝0.058 mg。称取样品需2次，1次毛重，1次空盘，计算得天平校准的不确定度为（0.0582×2）0.5＝0.082 mg。因此称取1.0 g油样的相对标准不确定度为0.082／1.0＝0.082 mg／g。同理，称取21.01 g柠檬酸和29.41 g柠檬酸钠的相对标准不确定度分别为0.003 9 mg／g和0.002 8 mg／g。因此称量过程电子天平引入的不确定度 μ4＝［（0.082）2+（0.003 9）2+（0.002 8）2］0.5＝0.082 mg／g。

2.3.5 玻璃量器产生的不确定度μ5

在电解液的配制、待测样品油的定容、标准过氧化月桂酰工作液的定容及浓度稀释过程中均会引入不确定度。25 mL刻度试管容量允许误差［16］为±0.25 mL，按均匀分布换算成标准偏差为0.25／30.5＝0.144，1 mL单标线吸管容量允许误差为±0.007 mL，按均匀分布换算成标准偏差为 0.007／30.5＝0.004 04，则相对标准不确定度分别为0.005 76和0.004 04。过氧化月桂酰标准溶液定容过程亦产生不确定度。本试验在室温下测定，温度变幅较小，且所用溶剂正丙醇／柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的混合液化学性质稳定，因此溶剂体系膨胀带来的不确定度忽略不计。所以标准溶液定容至25 mL容量瓶所引起的不确定度分2部分：①容量瓶体积的不确定度，根据 JJG196—1990《常用玻璃量器检定规程》［17］，25 mL A级单线容量瓶允差为 ±0.03 mL，按均匀分布，标准偏差为0.03／30.5＝0.017 3；②充满液体至容量瓶刻度的估读误差为（0.005×25）／30.5＝0.072 17；因此相对不确定度 μ＝［（0.017 32+0.072 172）0.5］／25＝0.003。A级 1 000 mL单线容量瓶的允许误差±0.4 mL，按均匀分布换算成标准偏差为0.4／30.5＝0.231，则相对标准不确定度为0.000 231；容量瓶定容体积读数时也会引起不确定度，1 000 mL单线容量瓶充满液体至容量瓶刻度的估读误差为（0.005×1 000）／30.5＝2.887（均匀分布），则相对不确定度为0.002 9。因此玻璃量器引入的不确定度 μ5＝［（0.005 76）2+（0.004 04）2+（0.002 9）2+（0.003）2］0.5＝0.008 2。

2.3.6 合成相对标准不确定度

该次检测的不确定度计算结果如表8所示。

表8 分析过程引入的相对不确定度分量表

通过不确定度计算发现，新方法的不确定度主要由平行测定产生的不确定度、标准曲线的不确定度及回收率产生的不确定度引起，其他不确定度来源可忽略，因此计算合成标准不确定度0.020，扩展不确定度在没有特殊要求的情况下，按国际惯例，测量结果的扩展不确定度包含因子K取2，因此相对扩展不确定度［18］为4.04%。由于当峰电流值为3.761×10-5A时，按式（1）和式（4）计算，对应的过氧化值浓度为0.048 mmol／kg，因此此次检测的不确定度为 0.048×4.04% ＝0.001 9 mmol／kg，检测过氧化值为（0.048±0.001 9）mmol／kg。

2.4 En数

利用比率值En对不满意的15个比对结果进行二次判定，首先根据2.3中的方法计算每次测定所产生的不确定度，之后结合对照实验室的不确定度，按式（3）计算，结果如表9所示。

表9 壳聚糖修饰电极法准确度二次评价

对15个样品En数的评价结果进行统计（表10），En数的绝对值分布区间为0.36～1.53，对于过氧化值较低的样品，试验引起的不确定度较大，因此检测值在0.016～0.075 mmol／kg范围内的12个样品有11个结果二次判定为满意，满意率达90.9%。但当测定值较大时（＞0.075 mmol／kg），试验引起的不确定度对测定结果影响较小，此时3个样品的二次判定结果中有1个样品二次判定为满意，满意率为33.3%。

表10 En值满意率统计

结合偏离度与比率值En数判定，比对的40个样品，壳聚糖修饰电极法与国标法定性判定全部一致，定量判断结果有37个满意，满意率为92.5%，其中0.016～0.075 mmol／kg区间内的结果更为准确，满意率为91.6%。

3 结论

由于壳聚糖修饰丝网印刷电极法测定植物油过氧化值使用的有机溶剂少、满足检测所需植物油样品量小、无需人为判断滴定终点，因此与国标法相比，在操作性、安全性等方面存在一定优势；在测定结果方面，综合偏离度与En数2项评价指标的评价结果，比对的40个植物油样品中，新方法与国标法在定性判定方面结果全部一致，而在定量判断方面有37个结果满意，整体满意率为82.5%，其中0.016～0.075 mmol／kg区间内的结果更为准确，满意率为91.6%。

虽然在绘制标准曲线时，结果显示过氧化值在0.02～5.00 mmol／kg范围内，与壳聚糖修饰电极产生的氧化峰电流值呈良好的对数关系（R＝0.993 5），但在本试验中采集得到的植物油样品过氧化值较小，未能对高过氧化值的植物油进行检测。因此，重点收集一定数量的高过氧化值植物油样品，对该方法进行进一步验证是今后的研究方向之一。

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Accuracy Evaluation of Determining Peroxide Value in Vegetable Oils by Microelectrode

Tao Sha1Wang Wei2Chen Fusheng3Zhang Hui1Xue Wentong1
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University1，Beijing 100083）
（Shijiazhuang Academy of Agriculture and Forestry Sciences2，Shijiazhuang 050041）
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology3，Zhengzhou 450001）

A New method in the determination of peroxide value has been developed，namely by differential pulse anodic stripping voltammetry；adopted chitosanmodified screen printing electrode scan vegetable oil samples to instead of titration to determine changes of the iodine ion concentration.In the research described in the paper，the proposed method determine peroxide value of 40 saled vegetable oil samples，and compare with the national standard method（GB／T 5538—2005）.Through evaluate comprehensive deviation degree and En value，it was determined that the resultswere all satisfied in the qualitative evaluation，and had 37 satisfied ones in respectof quantitative judgment，the overall satisfaction rate was92.5%.Especially in the range of0.016～0.075 mmol／kg the result ismore accurate and satisfaction rate can reach 91.6%.This research showed that compared with the national standardmethod，the new method in operational，security，etc.has a certain advantage，and the result accuracy could be recognized within the limits of certain peroxide value range.

En value，deviation degree，uncertainty evaluation，microelectrode，peroxide value，vegetable oils

TS207.3

A

1003-0174（2015）01-0129-07

国家自然科学基金（31171672），质检公益性行业科研专项（200910034-02）

2013-08-26

陶莎，女，1985年出生，博士，农产品加工及贮藏工程

薛文通，男，1962年出生，教授，农产品加工及贮藏工程