含维生素组合定痫胶囊与定痫胶囊加服维生素组合控制癫痫的疗效

常晓波

三二〇一医院 汉中 723000

癫痫是一种反复发作的慢性短暂性的脑功能失调的综合征，以反复的神经元异常放电为主要特征［1］。癫痫是神经内科的常见病，其发病率仅次于卒中。癫痫的治疗主要是控制痫性发作，目前以药物控制为主，临床根据癫痫类型选择药物，应不间断服药，主张单一用药，若效果不理想可以两种及以上药物联合应用［2］。近年来重要制剂在癫痫控制中的应用得到较为广泛的关注，但有效的药物报道较少［3］。本次研究应用60只大鼠作为实验材料，对比含维生素组合定痫胶囊与定痫胶囊加服维生素组合用于癫痫控制的疗效。

1 材料

1．1 实验动物 选用60只健康的雄性Wistar作为实验材料，体质量180～200g，平均（189．2±7．4）g，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号14-0122。

1．2 药物 戊四氮（Pentetrazole，PTZ，北京寰宇科创生物科技发展有限公司，批号：20130511）。菖连定痫胶囊（保定世臣癫痫病医院，批号：20120211）；维生素：谷维素（上海青平药业有限公司，批号：20121103），维生素C（四川金药师制药有限公司，批号：20131105）；维生素B6（浙江天新药业有限公司，批号：20130701），磷酸氢钙（南宁康诺生化制药有限责任公司，批号：201200706）。含维生素组合菖连定痫胶囊（保定世臣癫痫病医院，批号：20130207），维生素组合：谷维素10mg／kg，维生素B62mg／kg，维生素C 66 mg／kg，磷酸氢钙66mg／kg。丙戊酸钠（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：20130211）。

2 方法

2．1 模型构造 采用戊四氮腹腔注射（ig）法构建大鼠的癫痫模型：每天上午9：00～11：00时给大鼠注射PTZ，剂量为30～40mg／kg。对于出现持续性的Ⅵ级癫痫发作的个体立即注射1mL 7%的水合氯醛抢救。

2．2 分组及用药 60只大鼠按照随机数字法分为5组：A组（空白对照组）12只，不注射PTZ和抗癫痫药物；B～E 组的48只大鼠均应用PTZ构建癫痫大鼠模型：B组（模型对照组）12只，灌服生理盐水；C组（丙戊酸钠组）12只，大鼠灌服丙戊酸钠控制癫痫发作，剂量为15．75mg／kg；D 组（定痫胶囊＋维生素组合）灌服400 mg／kg的菖连定痫胶囊和维生素；E组（含维生素组合菖连定痫胶囊）灌服含维生素组合菖连定痫胶囊，剂量为500mg／kg。研究期间均采用普通饲料喂养，自由饮水。

2．3 大鼠海马区Bcl-2的表达水平检验

2．3．1 大鼠海马组织的获取：用水合氯醛经腹腔注射麻醉大鼠，打开胸腔，经升主动脉快速静滴200mL 生理盐水，继而注射200mL 的4%的多聚甲醛，先快速灌注，再缓慢静滴，然后取大鼠脑组织。在大脑的视交叉与视乳头切取冠状组织，剥离左右海马。

2．3．2 PCR 检测：大鼠的Bcl-2引物由上海生物工程公司合成，参照物选择GAPDH，由上海吉玛制药技术有限公司合成。DNA 模板5μL，PCR 缓冲液2μL，dNTP 2μL，MgCl 2 2μL，引物1（upward）0．5μL，引物2（downward）0．5μL，dH2O 7．75μL，Tag 0．25μL，共20μL 配成反应体系。94℃变性5min，94℃1min，5℃1min，72℃1min，顺序循环35次，72 ℃延伸5min，产物4 ℃保存。扩增产物在琼脂糖凝胶板上电泳，在凝胶自动成像仪下成像，观察、判定结果。2．3．3 Western blot法：使用Western blot检测大鼠海马组织中Bcl-2的表达水平：将组织剪开，加入胰蛋白酶消化，离心后收集细胞。使用预冷PBS洗涤将细胞冲洗2遍，裂解细胞后获取总蛋白。将蛋白定量后经SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭、切膜后加入兔抗鼠Bcl-2抗体（上海亿欣生物科技有限公司），4℃孵育过夜，洗涤后加入二抗（羊抗兔抗体），室温孵育1．5h后洗膜，ECL试剂盒曝光显影。

2．4 观察指标 （1）比较4组癫痫大鼠的惊厥发生率和病死率。（2）观察大鼠的癫痫发作级别的变化，分级标准［4］：未表现出行为发作为0 级，出现节律性点头或头部抽搐为1级，出现阵挛性咀嚼者为2级，出现前置阵挛性抽搐和头部震颤为3级，上身直立者为4级，大鼠跌倒者为5级，出现强直性惊厥者为6级。（3）比较实验前、用药1周、2周和4周后大鼠的惊厥持续时间和体质量的变化。（4）比较5组大鼠4周后海马区Bcl-2的表达水平变化。

2．5 统计学处理 采用SPSS 15．0软件进行分析，计量资料用±s表示，采用t检验和重复测量方差分析；计数资料采用χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

3 结果

3．1 癫痫大鼠的惊厥发生率和病死率比较 4周后4组癫痫大鼠的惊厥发生率和病死率有统计学意义（P＜0．05）。见表1。

表1 大鼠惊厥发生率和病死率比较 ［n（%）］

3．2 用药前后大鼠癫痫发作级别的变化比较 与用药前相比，C～E组大鼠的癫痫发作级别均明显减轻（P＜0．05）；C～E组大鼠用药后的癫痫发作级别较B 组明显减轻（P＜0．05）。见表2。

表2 用药前后大鼠的癫痫发作级别的变化 （±s）

表2 用药前后大鼠的癫痫发作级别的变化 （±s）

组别 n 癫痫发作级别用药前 用药后B组12 4．1±1．2 3．8±0．9 C组 12 4．2±1．3 1．9±0．4 D 组 12 4．0±1．1 2．0±0．6 E组 12 4．1±1．4 1．8±0．5组间 F＝5．73，P＜0．05时间 F＝6．12，P＜0．05组间＊时间 F＝2．07，P＞0．05

3．3 含维生素组合定痫胶囊与定痫胶囊加服维生素组合对惊厥持续时间和体质量的影响 与用药前相比，C～E 组大鼠的惊厥持续时间均明显缩短（P＜0．05）；C～E组大鼠用药后的惊厥持续时间较B组明显缩短（P＜0．05）；与用药前相比，C～E组大鼠的体质量均明显增加（P＜0．05）；C～E组大鼠用药后的体质量较B组明显增加（P＜0．05）。见表2。

表3 大鼠癫痫发作时间和体质量变化比较 （±s）

表3 大鼠癫痫发作时间和体质量变化比较 （±s）

组别 n 惊厥持续时间（min） 体质量（g）用药前 1周后 2周后 4周后 用药前 1周后 2周后 4周后B组 12 44．12±9．96 43．15±7．82 42．12±8．01 41．02±8．82 189．23±7．91 198．12±6．98 202．78±9．11 207．23±10．35 C组 12 45．32±10．02 32．14±5．83 28．85±4．02 14．18±2．15 191．82±8．17 218．23±10．25 252．25±15．98 285．12±24．87 D组 12 45．11±9．08 34．17±6．02 30．11±4．78 16．15±2．34 188．79±7．82 215．87±9．95 248．97±14．89 278．98±25．02 E组 12 45．16±9．45 32．08±5．65 27．31±4．52 13．97±2．18 192．13±7．23 220．94±11．24 255．45±17．32 291．82±27．13组间 F＝9．12，P＜0．05 F＝15．32，P＜0．05时间 F＝8．78，P＜0．05 F＝11．08，P＜0．05组间＊时间 F＝2．83，P＜0．05 F＝3．52，P＜0．05

3．4 大鼠海马区Bcl-2的mRNA 水平和蛋白水平检测 4周后5组大鼠海马区的Bcl-2的mRNA 水平比较差异有统计学意义（t＝4．72，P＜0．05），Bcl-2蛋白水平差异有统计学意义（t＝3．97，P＜0．05）。见图1和图2。

图1 大鼠海马区Bcl-2的蛋白质水平比较

图2 大鼠海马区Bcl-2的mRNA 水平比较

4 讨论

癫痫是神经元异常放电引起的慢性的反复发作的脑功能失调综合征，戊四氮腹腔注射是目前较为常用的诱导癫痫动物模型的方法［5］。临床上的癫痫控制以药物为主，尽管西药控制癫痫尽管疗效强、见效快，但不良反应较强，临床应用具有一定的局限性；研究发现，中药制剂用于癫痫控制长期疗效较为稳定，近些年来得到较为广泛的关注［6］。

中药制剂治疗癫痫的关键在于调整患者的功能状态。维生素C可以有效对抗自由基，有效避免神经元的氧化破坏，同时可以增加细胞内的钙离子浓度［7-8］。维生素B6的缺乏可导致脑内谷氨酸脱羧酶的活性下降，诱发癫痫发作［9-10］。中药制剂和维生素联合应用在癫痫的控制中具有一定的疗效。本次研究中，通过腹腔注射，笔者成功构建了48只大鼠的癫痫模型，用药4周后，灌服丙戊酸钠、定痫胶囊＋维生素组和含维生素组合大鼠的惊厥发生率和病死率明显低于模型对照组大鼠，且癫痫发作级别、惊厥持续时间和体质量均明显改善，3组服药的大鼠的疗效相当，说明定痫胶囊＋维生素组和含维生素组合在癫痫控制中疗效较为明显，与丙戊酸钠相当。癫痫的发生机制较为复杂，研究显示，癫痫持续发作状态可以导致神经元的损伤与凋亡，Bcl-2对于海马内损伤神经元具有一定的保护作用，Bcl-2的表达可以增加细胞对多数DNA 有害因子的抵抗能力［11-13］。与空白对照组相比，48只癫痫大鼠的Bcl-2表达水平均明显下降，说明癫痫大鼠的Bcl-2表达水平下降。服用丙戊酸钠、定痫胶囊＋维生素组和含维生素组合大鼠的Bcl-2表达水平高于模型大鼠组。说明定痫胶囊＋维生素组和含维生素组合菖连定痫胶囊以及丙戊酸钠均可有效对抗大鼠海马神经元的凋亡［14-15］。

本次研究显示，PTZ引发癫痫的大鼠在经定痫胶囊＋维生素组和含维生素组合菖连定痫胶囊治疗后，大鼠的惊厥发生率、病死率和癫痫发作级别均明显优于模型对照组，前2组大鼠的大脑海马组织中的Bcl-2表达水平均明显高于模型组大鼠，灌服定痫胶囊＋维生素组和含维生素定痫胶囊的2组大鼠的惊厥发生率、病死率、癫痫发作级别、警觉持续时间、体质量和Bcl-2表达水平无明显差异。综上，中药制剂应用于癫痫控制疗效稳定，不良反应较轻，具有一定的应用价值。

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