姜黄素对大鼠肝星状细胞中TGF-β调节的NADPH氧化酶4的激活及Smad信号通路的影响

王雅蕊，李 俊，黄 成，李小枫，李晓慧，王 欢

姜黄素对大鼠肝星状细胞中TGF-β调节的NADPH氧化酶4的激活及Smad信号通路的影响

王雅蕊1，2，3，李 俊1，2，3，黄 成1，2，3，李小枫1，2，3，李晓慧1，2，3，王 欢1，2，3

目的研究姜黄素潜在的抗纤维化作用，以及转化生长因子β（TGF-β）诱导大鼠肝星状细胞（HSC-T6）激活的机制方法不同浓度的姜黄素（0、5、10、20、40 μmol／L）处理HSC-T6后，用MTT法测定其对HSC-T6增殖作用的影响；用RT-PCR法检测其mRNA水平的表达；用Westem blot法检测表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、细胞外基质主要成分α1I胶原（Col1α1）、NADPH氧化酶4（NOX 4）、Smad 2、Smad 3及其磷酸化的水平结果40 μmol／L的姜黄素组刺激HSC-T6 48 h后，其抑制率达到最大，显著低于仅TGF-β1刺激组、5、10及20 μmol／L姜黄素组（P＜0．05）。姜黄素可显著降低激活型HSC-T6的α-SMA、α1I胶原mRNA与蛋白表达，从而可以降低细胞外基质的沉积；有效降低了NOX 4的蛋白水平，减少了活性氧的水平；还明显降低Smad 2、Smad 3的磷酸化程度，呈浓度依赖性结论姜黄素在体外能够明显地抑制HSC-T6激活，对肝纤维化的发生发展具有一定抑制作用，其机制可能与抑制TGF-β诱导的NOX4的激活及Smad信号通路有关。

姜黄素；大鼠肝星状细胞；转化生长因子β；NADPH氧化酶4；Smad蛋白

肝纤维化是指各种致病因子所致肝脏内弥漫性细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积的一个慢性肝损伤的病理过程。若控制不及时，可最终发展为肝硬化［1－2］。肝纤维化的标志是肝星状细胞的活化过程，而转化生长因子β（transforming growth factor-beta，TGF-β）通过其下游的Smad等可促进大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCT6）活化、增殖，从而在肝纤维化发生发展的进程中有重要作用［3］。NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX 4）是肝脏中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的一个主要来源。姜黄素是姜黄根茎中的一种黄色成分，具有抗癌、抗氧化和抗感染等特性［4］。研究［5－7］表明，姜黄素有抗肝纤维化作用，但其分子机制仍有待进一步研究。该研究旨在探讨姜黄素对TGF-β诱导HSC-T6中NOX 4的激活和Smad表达的影响，对肝纤维化和姜黄素干预的分子机制的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 细胞系HSC-T6细胞由上海中科院细胞库提供。细胞在常规培养基（DMEM高糖＋10%胎牛血清＋100 kU／L青霉素＋100 mg／L链霉素），在含5%CO2饱和湿度恒温培养箱条件（37℃）下孵育。取对数生长期细胞用于实验。

1．2 药品和试剂姜黄素（批号：BCBL0424V，质量分数≥99．8%）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、DMSO（美国Sigma公司）；TGF-β（美国R＆D Systems公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM高糖培养基（美国HyClone公司）；胰蛋白酶、PBS、RIPA强裂解液、PMSF（上海碧云天生物技术有限公司）；MML-V逆转录试剂盒、TRIzol（日本TaKaRa公司）；100次RT-PCR扩增试剂盒（美国Invitrogen公司）；RT-PCR引物的合成（上海生工生物工程技术服务有限公司）；BCA法蛋白浓度定量试剂盒（武汉生物科技有限公司）；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、α1I胶原（collagen type I，Col1α1）、NOX4单克隆抗体（美国Bioworld Technology）；磷酸化Smad 2和Smad 3单克隆抗体（美国Cell Signaling公司）；总Smad 2和Smad 3单克隆抗体（美国Bioworld公司）；β-actin多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；辣根过氧化酶标记抗兔和抗鼠IgG（北京中杉金桥公司）；ECL化学发光试剂盒（美国Pierce公司）。

1．3 主要仪器NAPCO-6100型细胞恒温培养箱由美国SHELLAB公司提供；SWCJ-1F型单人双面超净工作台由江苏苏州安泰空气技术有限公司提供；MLS-3020型自动高压灭菌锅由日本Sanyo公司提供；3-16K型高速冷冻离心机由美国Sigma公司提供；PCR梯度扩增仪由德国Eppendoff公司提供；十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）仪由美国BioRad公司提供。

1．4 MTT检测调整传代HSC-T6细胞悬液浓度，约为1×104个／ml后接种于两个96孔板中，每孔200 μl细胞悬液，放于37℃、5%CO2恒温箱培养。待细胞贴壁后除对照组和仅加TGF-β刺激组外，其他加药组分别加入终浓度各为5、10、20、40 μmol／L的姜黄素，作用30 min后，除对照组外每组加入TGF-β（10 ng／ml）刺激细胞同时分别培养24 h和48 h，分成6组：对照组，TGF-β刺激组，TGF-β＋5 μmol／L姜黄素组，TGF-β＋10 μmol／L姜黄素组，TGF-β＋20 μmol／L姜黄素组，TGF-β＋40 μmol／L姜黄素组，至作用时间后加入5 mg／ml MTT溶液20 μl，培养4 h。移除上清液，每孔加入DMSO 150 μl，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪检测波长490 nm处各孔的吸光度（absorbance，A）值。评估姜黄素对HSC-T6细胞增殖的抑制作用。

1．5 RT-PCR检测按TRIzol试剂说明书提取经处理后的HSC-T6总RNA，再立即用紫外分光光度计测定总RNA浓度，测定A260∶A280比值，重复3次，测得该比值稳定于1．8～2．0。逆转录得到的cDNA后进行扩增，以β-actin作为检测的内参物，RT-PCR扩增的反应体系为25 μl，包括cDNA 1 μl，上下游引物各0．5 μl，Mix 12．5 μl，用无酶水补至总体积25 μl。PCR反应参数：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，总共扩增35个循环。最终所得的扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色。通过光密度扫描，以目的条带与内参条带的灰度值比值作为目的基因的相对转录量再进行统计学分析。引物序列、产物片段长度及反应条件见表1。

1．6 Western blot法检测HSC-T6细胞用冰冷的RIPA裂解缓冲液加PMSF冰上裂解30 min，收集细胞裂解物，于4℃、12 000 r／min离心30 min，吸取上清液，BCA法测定蛋白浓度。蛋白上样量为50 μg，进行10%或12%聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，再转移到活化的PVDF膜上，非特异性封闭3 h，加入一抗，4℃过夜。次日含辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，后用TBST洗膜4次，每次10 min，最后用ECL发光剂进行检测，曝光、显影，以β-actin作为内参，分别以目的蛋白与β-actin光密度比值作为该目的蛋白的相对表达量。

1．7 统计学处理采用SPSS 13．0软件进行统计分析，数据以±s表示，组间均数比较采用方差分析、t检验。检验水准α＝0．05，所有检验均为双侧检验。

2 结果

2．1 姜黄素对TGF-β诱导活化的HSC-T6细胞增殖的影响MTT法检测显示，与对照组相比，经TGF-β 10 ng／ml刺激后，HSC-T6细胞的增殖活性明显增强；与TGF-β刺激组相比，姜黄素组HSC-T6增殖能力明显减弱，差异有统计学意义（P24h＜0．05、0．01，F＝37．318），（P48h＜0．01，F＝165．123），且呈浓度相关性，当浓度达到40 μmol／L时抗增殖作用非常显著。见图1。

2．2 姜黄素对TGF-β刺激HSC-T6的激活及细胞外基质沉积的影响扩增产物凝胶电泳结果见图2。与未处理的对照组相比，经TGF-β 10 ng／ml刺激后α-SMA和α1I胶原mRNA明显增高；与TGF-β刺激组相比，TGF-β加不同浓度姜黄素组通过减少α-SMA mRNA与α1I胶原mRNA水平的表达，从而减少了细胞外基质的沉积，差异有统计学意义（P＜0．01，F＝58．102；P＜0．01，F＝315．856）。免疫印迹检测结果显示，HSC-T6细胞经姜黄素处理后，α-SMA和α1I胶原表达均有不同程度的下降，且呈浓度相关性，差异有统计学意义（P＜0．01，F＝356．227；P＜0．01，F＝28．952），见图3。

2．3 姜黄素对TGF-β诱导的NOX4表达的影响

NOX4的蛋白水平在激活的HSC-T6（TGF-β刺激组）中上调。而经不同浓度的姜黄素处理后，明显稀释了TGF-β诱导的NOX 4的上调作用，而且呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0．01，F＝30．888），见图4。

2．4 姜黄素对TGF-β诱导的Smad表达的影响Western blot法实验结果表明，HSC-T6细胞经TGF-β（10 ng／ml）作用24 h后，与对照组相比，Smad磷酸化水平phospho-Smad 2（p-Smad 2）、phospho-Smad 3（p-Smad3）明显上调，但经和姜黄素一起作用后，与仅TGF-β 10 ng／ml相比，Smad2的磷酸化水平逐步下降，差异有统计学意义（P＜0．01，F＝72．400），而且Smad3的磷酸化水平也逐步下降（P＜0．01，F＝13．303），见图5。Smad 2和Smad 3蛋白本身无显著变化。

3 讨论

多个复杂信号通路，包括氧化应激和Smad信号，参与TGF-β诱导的HSC-T6激活。氧化应激在各种疾病中起着重要作用，通过超氧化物和过氧化氢的形式产生活性氧。之前的研究［8］表明，氧化应激在各种细胞中参与调节TGF-β诱导的各种细胞反应。而在HSC-T6中，氧化应激的主要来源来自NADPH氧化酶；是一个由多种亚单位组成的，含有6个α螺旋跨膜结构域的酶复合体。NADPH氧化酶家族包括7个成员，其中，NOX 4在HSC-T6表达并通过特定的细胞内信号使HSCs活化，从而促进肝纤维化形成。因此，通过阻断NOX 4产生ROS，可能会阻止肝纤维化形成。

目前，许多研究［9］表明，TGF-β是肝纤维化发展的关键因子。因此，TGF-β信号级联就成为了研究种种致病因子所导致肝脏病变的潜在目标。TGF-β结合其受体后激活，其信号传递需要一系列受体后信号分子。之前有研究［10］表明，Smad蛋白是TGF-β受体作用的胞内激酶底物，有效地介导了TGF-β在细胞内的信号转导。Smad家族蛋白由受体调节型Smad蛋白（Smad 2、Smad 3）、共同调节型Smad蛋白（Smad 4）和抑制型Smad蛋白（Smad 6、Smad 7）3类组成。TGF-β刺激激活其受体，作用于胞质内下游分子，激活的Smad 2、Smad 3与Smad 4形成异源寡聚物，将TGF-β信号从胞质移到细胞核中，同时招募其他转录调节因子共同调节下游靶基因的转录。TGF-β／Smads是经典的信号转导通路之一，其信号转导的基本过程为：TGF-β首先在细胞外与细胞膜表面TβRⅡ结合，同时激活TβRⅠ，作用于下游因子，使Smad 2／3磷酸化，Smad 2／3激活与Smad 4形成R-Smad-Smad 4复合物进入胞核发挥转录调节作用［11］。因此，本实验通过检测p-Smad 2／3水平作为TGF-β信号通路的激活水平和强度。在慢性肝损伤的情况下，通过TGF-β／Smad信号通路激活HSC-T6，导致HSC-T6活化增殖，转化为成纤维细胞，刺激ECM的合成，而且增加金属蛋白酶组织抑制因子表达，从而抑制细胞外基质ECM降解，使ECM降解和合成严重失衡，ECM沉积过度，促进肝纤维化的进展［12］。

既往研究［13］结果显示，姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗感染及抗肿瘤等作用。但是，姜黄素的作用分子机制复杂，可能有各种信号分子参与。本实验将培养的HSC-T6细胞为研究对象，在体外TGF-β诱导的HSC-T6细胞NOX4的表达和Smads信号转导通路姜黄素的干预作用，进一步探讨姜黄素防治肝纤维化的作用机制。本研究显示，NOX4蛋白表达在TGF-β刺激下上调，而姜黄素剂量依赖性地降低其上调作用，由此得出姜黄素在HSCs中通过改变NOX4的表达从而调控ROS信号。相似地，HSC-T6细胞经TGF-β（10 ng／ml）作用24 h后，与对照组相对比，Smad2、Smad3的磷酸化水平显著增强，差异有统计学意义结果说明，TGF-β过表达激活了Smad信号转导途径，使R-Smad（Smad2、3）表达增强，进而使信号得以传递。但经姜黄素干预后，Smad2、3的磷酸化程度受到抑制，与仅TGF-β刺激组相比有显著性差异。说明姜黄素具有下调NOX4及Smad 2、Smad 3的表达，并抑制TGF-β／Smad信号转导，进一步揭示了肝纤维化的预防和治疗的机制。

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Curcumin attenuates hepatic fibrogenesis through interrupting TGF-β-mediated NADPH oxidase 4 activation and Smad signaling in vitro

Wang Yarui1，2，3，Li Jun1，2，3，Huang Cheng1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，2Institute for Liver Diseases，Anhui Medical University，Hefei 230032；3Institute for Innovative Drug Industrial Generic Technology Research of Anhui，Hefei 230032）

ObjectiveTo observe the effects of curcumin on activation and proliferation of hepatic stellate cells（HSCs）and，their expression of NADPH oxidase 4（NOX 4）and smad signaling factors of rat hepatic stellate cells line in vitro using a rat HSC line．Methods Synchronized HSC-T6 cells were treated with different dose of purified curcumin（0，5，10，20，40 μmol／L）．Untreated cells were viewed as controls．MTT technique analysis was used to examine the proliferation of the hepatic stellate cells stimulated by differernt concentration of curcumin；the mRNA expression of α-smooth muscle actin（α-SMA）and main constituents in extracellular matrix I procollagen（α1I collagen）were determined by RT-PCR in TGF-β-stimulated HSCs，and the antifibrotic effects on the protein expression of α-SMA，α1I collagen，NADPH oxidase（NOX）protein（NOX 4）and the phosphorylation level of smad 2 and smad 3 was assessd by western blot；beta-actin（β-actin）was detected as the normalization control in the hepatic smllate cells was examined by Western blot analysis．Results The inhibition rate of HSC-T6 cells was the largest with curcumin for 48 h，significantly lower than that of TGF-β-stimulated group，5 μmol／L，10 μmol／L and 20 μmol／L group（P＜0．05）．Notably，curcumin could obviously reduce the expression of α-SMA and α1I collagen at both mRNA and protein levels and reduce the deposition of extracellular matrix．Treatment of curcumin markedly blocks up-regulation of NOX4 by TGF-β．It also significantly reduced TGF-β-induced Smad 2／3 phosphorylation，and this effect observed dose-dependent．Conclusion Curcumin inhibited TGF-β-mediated HSC activation in vitro，which was involved in Smad signaling pathway，and consequently influenced the profibrotic actions of TGF-β on HSC-T6 cells．Our results suggest that curcumin could become potential candidate for the therapeutic applications by inhibiting the TGF-β induced NOX activation and Smad signaling．

curcumin；rat hepatic stellate cell；transforming growth factor-β；NADPH oxidase 4；drosophila mothers against decapentaplegic protein

R 962．1；R 967

A

1000－1492（2015）03－0319－05

2014－11－12接收

国家自然科学基金（编号：81273526）

安徽医科大学1药学院、2肝病研究所，合肥 230032

3安徽创新药物产业共性技术研究所，合肥 230032

王雅蕊，女，硕士研究生；李 俊，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：lj＠ahmu．edu．cn