雷公藤内酯醇对大鼠变应性鼻炎TLR2-NF-κB信号通路的干预作用

杨春治(中国政法大学比较法学研究院比较法学研究所，北京 00088;福建医科大学基础医学院)

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)在临床上主要表现为鼻塞、鼻痒、喷嚏频繁、常有大量清水样鼻涕等特征，长期慢性AR还会引起头痛、嗅觉减退等症状。目前，AR的治疗主要可分为六大方法，即避免与变应原接触、药物治疗、免疫治疗、物理化学治疗、手术治疗和中医治疗。其中，药物治疗由于应用简便、效果明显而成为治疗AR的首选方法，主要包括抗组胺药物、肥大细胞稳定剂、减充血剂、白三烯受体阻滞剂、糖皮质激素等。但由于大部分药物有一定程度的毒副作用而不能长期使用，如抗组胺药物都有不同程度的中枢抑制作用，长期全身使用糖皮质激素会产生毒性［1-3］。

雷公藤内酯醇(triptolide，TP)是从卫矛科植物雷公藤中分离出的活性最高的环氧化二萜内酯化合物，具有较强的抗炎及免疫抑制活性，临床上广泛用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、肝炎、各类肿瘤、血小板减少性紫癜和各种皮肤病，毒副作用极小［4-7］。AR发病机制较复杂，目前尚未阐明，因此，研究AR发病过程中TLR2-NF-κB信号通路对深入研究AR发病机制具有一定的指导意义。同时，对AR的药物干预治疗或免疫抑制治疗提供一种新的思路。本课题拟采用TLR2的激动剂肽聚糖(PTG)以及NF-κB的抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)首先研究大鼠AR发病过程中TLR2-NF-κB信号通路各细胞因子的变化，确认AR发病过程中TLR2-NF-κB信号通路是髓样分化因子(MyD88)依赖性信号通路还是MyD88非依赖性信号通路。确定TLR2-NF-κB信号通路类型之后再采用TP进行干预，观察TP对AR发病过程中TLR2-NF-κB信号通路的影响，并初步探讨AR发病机制和TP可能存在的药用价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

雷公藤内酯醇(上海经科化学);PTG，PDTC，OVA(Sigma公司，USA);兔抗大鼠 β-actin单抗(Abcam，UK);兔抗大鼠 TLR2、IFN-β、NF-κB、IκB、IgE、MyD88、IRAK-1、TRAF-6、IL-1、IL-6、TNF-β 多抗(Abcam，UK);RIPA裂解液(碧云天);柠檬酸抗原修复液、EliVision Super检测试剂盒、DAB显色试剂盒(福州迈新生物公司);ECL发光液、显影液、定影液(厦门泰京生物公司)。

1.2 实验动物与分组

健康SD雄性大鼠60只，由福建医科大学实验动物中心提供，许可证编号:SCXK(闽)2012-0001，动物质量合格证编号:0000012。随机分为五组(n=12):对照组、模型组、TP组、PTG组和PDTC组。模型组:①基础致敏:用0.3 mg卵清白蛋白(OVA)加30 mg Al(OH)3混于1 ml生理盐水中，行腹腔注射，隔日1次，连续7次;②强化致敏:基础致敏结束后向每只大鼠雾化吸入2 ml浓度为2.5 μg/ml的OVA，每日1次，连续5 d;③激发:间隔3 d后向大鼠每侧鼻孔滴入10%OVA 50 μl，每日1次，连续7 d。PTG组:腹腔基础致敏后，在局部OVA喷鼻激发过敏状态同时采用50 μg/ml PTG滴鼻，每日1次，连续7 d;PDTC组:基础致敏前1 d腹腔注射120 mg/kg PDTC，每日1次，连续7 d;TP组:基础致敏前1 d腹腔注射30 mg/kg TP，每日1次，连续7 d。PDTC组和TP组不注射PTG。

1.3 大鼠变应性鼻炎模型的评价

从初次滴鼻激发开始，观察大鼠抓鼻、打喷嚏及流涕情况。经OVA滴鼻10 min后，单独观察30 min并进行叠加得分评价动物模型(见表1)，得分超过5分表示造模成功［8］。分别对抓鼻和打喷嚏次数进行计数资料统计。

表1 大鼠变应性鼻炎模型建立后症状积分评估Table 1 Assessment of symptom score after establishment of AR model in rat

1.4 Western blot检测大鼠鼻黏膜组织中 TLR2-NF-κB信号通路相关细胞因子的表达

按凯基组织蛋白提取试剂盒说明书操作步骤提取大鼠鼻黏膜组织中的蛋白，并调整浓度为20 mg/ml。样品与上样缓冲液混合后100℃加热5 min变性，然后取样品处理液进行10%SDS-PAGE电泳，转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h。洗膜后将封闭后的PVDF膜与一抗(TLR2、IFN-β、NF-κB、IκB、IgE、MyD88、IRAK-1、TRAF-6、IL-1、IL-6、TNF-β，各一抗浓度按说明书配制)4℃孵育过夜。洗膜后在室温条件下与二抗孵育1 h，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶5 000)。洗膜后加入免疫印迹化学发光试剂(ECL)，显影、洗片、晾干。用凝胶图像分析仪扫描照片，并采用灰度分析计算各蛋白条带的灰度值。

1.5 统计学分析

用SPSS16.0统计分析软件进行数据统计分析。所有的数据表示为±s，两组间比较采用t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠变应性鼻炎模型的建立及TP的干预作用

实验结果显示，模型组大鼠打喷嚏次数和抓鼻次数明显多于对照组，且在一周内总体随时间延长大鼠打喷嚏次数和抓鼻次数增多(见表2，表3)，说明大鼠变应性鼻炎模型建立成功。从第3天开始，TP组大鼠打喷嚏次数和抓鼻次数虽然明显高于空白组，但却明显低于模型组。

2.2 Western blot检测大鼠 TLR2-NF-κB 信号通路

Western blot实验结果显示，模型组大鼠鼻黏膜组织中 TLR2、MyD88、IRAK-1、TRAF-6、NF-κB、IκB、IL-1、IL-6、TNF-β和IgE的蛋白表达水平都明显高于空白组(见图1，表4)。PTG组中除IFN-β以外，以上其他细胞因子的蛋白表达水平都高于模型组。PDTC组中除IFN-β以外，以上其他细胞因子的蛋白表达水平都明显低于PTG组;NF-κB、IκB、IL-1、IL-6、TNF-β和 IgE表达水平明显低于模型组，但TLR2、MyD88、IRAK-1、TRAF-6 的蛋白水平与模型组无明显差异。

表2 大鼠打喷嚏次数的变化及TP的干预作用Table 2 The changes of sneezing times after the intervention of triptolide

表3 大鼠抓鼻次数的变化及TP的干预作用Table 3 The changes of catching nose times after intervention of triptolide

图1 Western blot检测大鼠鼻黏膜组织中的TLR2-NF-κB信号通路Figure 1 Expression of cytokines in TLR2-NF-κB signaling pathway in rat nasal mucosa by Western blot

表4 大鼠鼻黏膜组织中的TLR2-NF-κB信号通路相关细胞因子的蛋白相对表达量Table 4 Relative expression levels of cytokines in TLR2-NF-κB signaling pathway in rat nasal mucosa

2.3 Western blot检测TP对大鼠鼻黏膜信号通路的影响

Western blot实验结果显示，模型组大鼠鼻黏膜组织中 TLR2、MyD88、IRAK-1、TRAF-6、NF-κB、IκB、IL-1、IL-6、TNF-β和IgE的蛋白表达水平都明显高于空白组。TP组中以上细胞因子的表达水平都明显低于模型组。除 IRAK-1、NF-κB、IL-1、IL-6、IgE 以外，其余细胞因子的表达水平与对照组无显著差异(见图2，表5)。

图2 Western blot检测雷公藤内酯醇对大鼠鼻黏膜组织中TLR2-NF-κB信号通路的影响Figure 2 The effect of triptolide on expression of cytokines in TLR2-NF-κB signaling pathway in rat nasal mucosa by Western blot

表5 雷公藤内酯醇对大鼠鼻黏膜组织中TLR2-NF-κB信号通路的影响Table 5 The effect of triptolide on expression of cytokines in TLR2-NF-κB signaling pathway in rat nasal mucosa

3 讨论

TLRs介导的信号通路研究主要集中于TLR2和TLR4，该信号通路可分为髓样分化因子88(myeloid differentiation marker 88，MyD88)依赖性和非依赖性通路，其中以MyD88依赖性通路为主［9-11］。当机体受到外源分子刺激时，MyD88先与TLRs和Toll/IL-1受体同源性区域(TIR)相结合，促使IL-1受体相关激酶4(IRAK-4)磷酸化，IRAK-4磷酸化后激活IRAK-1，随后激活肿瘤坏死因子受体相关基因6(TRAF-6)，进一步活化转化生长因子 β激酶(TAK1)，活化后的 TAK1会促使 κB激酶 β 磷酸化，最终激活 NF-κB，诱导炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-β、IgE 等)的表达［12，13］，AR 发病过程中假设的TLR2-NF-κB信号通路见图3。

Fransson等发现，AR患者接触过敏原后TLR2、TLR3、TLR4 等 Toll样受体的表达量明显增加［14］。大量研究表明TLR2对变应性反应有促进作用［15，16］。目前关于AR发病过程中的信号通路研究较少，目前的研究主要集中在TLRs介导的MyD88依赖性信号通路为主。为了研究TLRs介导的信号通路在AR发病过程中作用，本研究采用建立动物模型、使用信号通路激动剂和阻断剂的方法研究TLR2在大鼠AR发病过程中的作用。

实验结果显示，TP组大鼠打喷嚏次数和抓鼻次数虽然明显高于空白组，但却明显低于模型组。且模型组大鼠鼻黏膜组织中 TLR2、MyD88、IRAK-1、TRAF-6、NF-κB、IκB、IL-1、IL-6、TNF-β和IgE的蛋白表达水平都明显高于空白组，说明大鼠变应性鼻炎模型建立成功。模型组、PTG组、PDTC组和空白组TNF-β的表达水平都无明显差异，说明PTG和PDTC对TNF-β的表达未造成影响。MyD88非依赖性信号通路中机体对病原体感染产生相应的有效应答，借助Toll样受体相关分子(TRAM)与Toll样受体相关的干扰素活化因子(TRIF)链接，诱导TNF-α/β表达。因此，根据实验结果推测，TLR2介导的TLR2-NF-κB信号通路是MyD88依赖性信号通路，而非MyD88非依赖性信号通路。

图3 AR发病过程中TLR2-NF-κB信号通路假设图Figure 3 The hypothesis of TLR2-NF-κB signaling pathway in pathogenesis of AR

PTG组中除TNF-β以外，其他细胞因子的蛋白表达水平都高于模型组。PDTC组中除TNF-β以外，其他细胞因子的蛋白表达水平都明显低于PTG组，NF-κB、IκB、IL-1、IL-6、TNF-β 和 IgE 表达水平低于模型组，但 TLR2、MyD88、IRAK-1、TRAF-6 的蛋白水平与模型组无明显差异。说明TLR2在TLR-2-NF-κB 信号通路上游，NF-κB 在 TLR-2-NF-κB 信号通路中游。TP对大鼠变应性鼻炎的干预实验结果发现，TP不仅可以减缓大鼠变应性鼻炎症状，还可抑制TLR-2-NF-κB信号通路中除TNF-β以外的其他细胞因子的表达。

因此，本研究提出 TLR2介导的 TLR-2-NF-κB信号通路为MyD88依赖性信号通路:即大鼠鼻黏膜受过敏原刺激后激活TLR2，随之与MyD88结合，促使IRAK-4磷酸化，磷酸化的IRAK-4激活IRAK-1，进一步激活 TRAF-6。接着 NF-κB被激活，与 IκB结合后激活炎症相关因子 IL-1、IL-6、TNF-β、IgE 的表达，从而引发变应性鼻炎。而雷公藤内酯醇通过抑制 TLR2与 MyD88的结合来抑制 TLR-2-NF-κB信号通路，从而起到减轻变应性鼻炎的作用，为治疗变应性鼻炎新药开发提供参考。

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