microRNA-181b在胰腺癌患者血浆中的表达及意义

周晋航，王江华，陈先祥，吴黎明，吴士兴，王 伟(湖北医药学院附属人民医院普外科，十堰 442000;通讯作者，E-mail:zhoujinhangdr@126.com)

胰腺癌(pancreatic cancer)是一种常见的消化系统恶性肿瘤，临床上主要表现为腹痛、食欲不振、消瘦和黄疸等，由于其恶性程度高、早期诊断和治疗困难，是临床预后最差的恶性肿瘤之一。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是广泛存在于真核生物中的一类长度约为18-24个核苷酸、不编码蛋白质的的单链非编码RNA分子，参与了细胞生长、增殖、发育和凋亡等生理过程，与肿瘤的发生发展密切相关［1，2］。miR-181b是miRNA-181家族成员之一，研究证实miR-181b参与胃癌、肝癌、肺癌、胶质瘤、子宫颈癌、淋巴细胞白血病等肿瘤的发生发展［3-10］，并与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。国内外学者研究发现在胰腺癌细胞株和胰腺癌组织中高表达miR-181b［11-13］，本研究通过检测胰腺癌患者血浆中miR-181b的水平，并分析miR-181b水平与年龄、性别、吸烟、局部淋巴结转移、远处转移、CA199浓度及肿瘤分期等病理参数之间的关系，初步探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取35例2013-091～2014-09在我院普外科住院确诊的胰腺癌患者，其中男性21例，女性14例，年龄44-79 岁，平均年龄(63.07 ±18.13)岁，所有病例均经过术后病理结果证实，采样前未进行手术、放疗或化疗等抗肿瘤治疗。临床分期:Ⅰ期2例、Ⅱ期9例、Ⅲ期11例、Ⅳ期13例。35例同期在我院健康体检中心进行体检的健康志愿者作为正常对照组，其中男性20例，女性15例，年龄42-73岁，平均年龄(58.74±14.85)岁。两组研究对象性别、年龄的比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。无菌采集两组研究对象外周静脉血5.0 ml，置于EDTA抗凝管中，分别2000 r/min离心10 min、4℃ 12000 r/min离心10 min后，收集上层血浆，-80℃保存待用。本实验经医院伦理委员会批准且所有研究对象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器 mirVanaTMmiRNA分离试剂盒购自美国 Ambion公司，miScript Reverse Transcription试剂盒购自美国Ambion公司，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ购自大连宝生物工程有限公司，荧光定量PCR扩增仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2.2 实时定量PCR检测血浆中miR-181b水平 采用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒提取血浆中总RNA，实验操作严格按照试剂盒说明书进行，提取的RNA溶于DEPC水中，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，A260/A280比值在1.8-2.1的RNA用于进行逆转录反应。根据文献［14］合成miR-181b茎环RT引物及PCR引物，见表1、表2。

表1 逆转录引物Table 1 Reverse transcription primers

表2 合成miR-181b的PCR引物Table 2 PCR prim ers of miR-181b

利用miScript Reverse Transcription试剂盒进行cDNA 合成，10 μl反应体系包括2.0 μl总 RNA、1.0 μl茎环 RT 引物、5.0 μl逆转录缓冲液(2 × )、0.5 μl逆转录酶、0.5 μl RNA 酶抑制剂及 1.5 μl DEPC水。反应条件:16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。20 μl PCR反应体系包括上下游引物各1.0 μl、10 μl PCR 反应缓冲液(2 × )、4.0 μl模板、4.0 μl ddH2O;反应条件为95℃ 预变性3 min，95℃ 变性5 s、60℃退火延伸45 s，35个循环，扩增结束后获得循环阈值(CT值)，每个样本做三个复孔，采用2-ΔΔCt分析 miR-181b 的表达水平，ΔΔCt= 实验组ΔCt(目的基因Ct-内参基因Ct)-对照组ΔCt(目的基因Ct-内参基因Ct)。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS 16.0软件进行统计学处理，计量资料采用±s表示，计数资料比较采用χ2检验，miR-181b与临床病理参数的关系采用独立样本 t检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象血浆中miR-181b水平比较

定量PCR结果显示:胰腺癌患者血浆中miR-181b 水平(0.63 ±0.24)明显高于正常对照组(0.32±0.12)，差异具有统计学意义(t=6.835，P ＜0.01，见图1)。

图1 miR-181b及U6基因扩增曲线Figure 1 Amplification curve of miR-181b and U6

2.2 血浆中miR-181b水平与胰腺癌临床病理特征的关系

胰腺癌患者血浆中miR-181b水平在不同年龄、不同性别、有无吸烟史、不同CA199浓度之间差异均无统计学意义(P＞0.05)，而Ⅲ-Ⅳ期胰腺癌患者血浆中miR-181b水平明显高于Ⅰ-Ⅱ期患者，差异具有统计学意义(P＜0.05)，有局部淋巴结转移的胰腺癌患者血浆中miR-181b水平明显高于未有局部淋巴结转移的胰腺癌患者，差异具有统计学意义(P＜0.05)，发生远处转移的胰腺癌患者血浆中miR-181b水平明显高于未发生远处转移的胰腺癌患者，差异具有统计学意义(P＜0.05，见表3)。

表3 血浆miR-181b水平与胰腺癌临床病理特征的关系Table 3 Relationships between the plasma levels of miR-181b and clinicopathological characteristics of pancreatic cancer

3 讨论

胰腺癌发病机制尚未完全明确，可能是多种因素长期共同作用的结果，与长期大量吸烟、饮酒、饮咖啡、糖尿病及慢性胰腺炎有关，遗传因素也可能与发病有关。胰腺癌治疗效果也不理想，死亡率很高，5年生存率＜1%，目前胰腺癌诊断主要依靠临床症状和影像学检查，早期诊断非常重要。自从miRNAs被发现以来，越来越多的证据表明在许多人类肿瘤组织中miRNA较正常组织表达异常，在肿瘤的发生发展过程中发挥类似癌基因或抑癌基因的作用，与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、凋亡和耐药等多种生物学过程密切相关［3-10］。

miRNA-181家族成员主要包括miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d，在心血管疾病、免疫性疾病及肿瘤疾病中发挥重要作用。miRNA-181家族发挥作用的机制也主要是通过靶mRNA的3'-UTR序列互补结合，抑制其翻译或降低其稳定性，进而达到精确调控基因表达的作用。miR-181b是近年来研究比较多的miRNA-181家族成员，在各种实体肿瘤和血液系统肿瘤中表达异常。国内学者研究发现miR-181b在胃癌组织中表达水平显著增高，提示miR-181b可能发挥促癌作用［4］。但也有学者研究发现miR-181b在胃癌组织中表达量显著下调，其靶基因为cAMP反应原件结合蛋白1(cAMP responsive element binding protein 1，CREB1)［5］。在肝癌的研究中发现4种miR-181家族成员在肝癌肝细胞中均表达上调，在肝癌的动物模型中也发现肝癌组织中miR-181b呈上调表达［6，7］。在耐药肺癌细胞株中发现miR-181b的表达水平显著低于其在非耐药肺癌细胞株中的表达水平，通过外源性转染过表达miR-181b可使耐药肺癌细胞恢复对相应药物的敏感性［8］。在胶质瘤组织中miR-181b表达显著降低，且与胶质瘤的临床分期及预后密切相关［9，10］，Chen等［14］研究证实在急性髓性白血病细胞中miR-181b表达显著上调。

多种miRNA在胰腺癌中也表达异常，国外学者利用RT-PCR技术在胰腺导管内乳头状黏液瘤组织中筛选出10种高表达的miRNAs［11］，多项研究发现胰腺癌组织中miR-21、miR-155、miR-21高表达，且与临床分期有关［15，16］。利用microRNA芯片研究发现与胰腺炎组织相比，miR-181b在胰腺癌组织中高表达［11］。Panarelli等［12］利用定量 RT-PCR 检测发现miR-181b在胰腺癌组织中高表达，microRNA芯片也验证了这一结果。国内学利用免疫组化检测胰腺癌组织中microRNA的表达情况，结果发现胰腺癌组织中miR-181b水平明显高于其在正常胰腺组织中的表达［13］。由于miRNA的长度较短，且在血液中与蛋白质结合在一起，在血液中可以稳定存在［17］。为了进一步研究miR-181b在胰腺癌中的作用，我们利用茎环RT-PCR方法检测了胰腺癌血浆中miR-181b水平，结果发现胰腺癌患者血浆中miR-181b水平显高于正常对照组(P＜0.01)，这与miR-181b在胰腺癌组织中的表达一致［11-13］。我们还分析了胰腺癌患者血浆中miR-16水平与临床病理特征之间的关系，胰腺癌患者血浆中miR-181b水平高低与患者年龄、性别、吸烟、CA199浓度均无明显相关(P＞0.05)，而与肿瘤分期、局部淋巴结转移及远处转移明显相关(P＜0.05)，提示miR-181b可能与胰腺癌的临床分期及预后有关，但这需要进一步扩大样本量，同时进行长期随访研究。

综上所述，在胰腺癌患者血浆中miR-181b的水平增高，且与肿瘤分期及远处转移有关，miR-181b可能参与胰腺癌的发生发展过程。随着对miR-181b研究的不断深入，miR-181b有可能成为胰腺癌早期诊断、临床分期及预后的新的分子标志物。

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