晚期非小细胞肺癌患者外周血游离DNA中EGFR突变与靶向药物一线治疗疗效的相关性

张世强，张旭东，王保庆，王海清(徐州医学院第二附属医院放疗三科，徐州 006;徐州医学院第二附属医院肿瘤内科;徐州医学院第二附属医院呼吸内科;通讯作者，E-mail:zxdmail8@sohu.com)

肺癌是世界上发病率及死亡率较高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(NSCLC)在肺癌中约占85%，大部分患者确诊时已处于晚期，对于中晚期肺癌患者的治疗目前仍以姑息性化疗为主，改善症状。但第三代化疗药物的临床应用未能明显改善患者的预后，大部分患者经过化疗治疗后1年的生存率仍维持在约35%-40%左右［1-3］，而且化疗药物的毒副反应极大降低了患者的生活质量。随着医学技术的发展，目前靶向药物如吉非替尼、厄洛替尼已广泛用于肺癌的临床治疗，取得较好的临床疗效，而且成为肺癌综合治疗领域的研究热点。

靶向药物在NSCLC患者治疗中的疗效已获得国内外肿瘤专家的认可，其疗效与肺癌细胞EGFR基因第19和21外显子突变状态有着密切的关系，是临床应用靶向药物治疗的重要依据。由于大部分肺癌患者确诊时已处于肿瘤晚期，无法获得足够用于检测EGFR基因突变的肺癌组织标本。目前已有大量的研究证实［4-6］，外周血游离DNA中EGFR基因突变状态与肿瘤组织中的EGFR基因突变状态具有高度的相关性，且外周血取材方便，故本研究的目的是通过检测外周血游离DNA中EGFR基因突变状态，探讨其指导晚期NSCLC患者口服吉非替尼作为一线治疗的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

入组的31例患者来自于我院2012-09～2014-10收治的晚期NSCLC患者，均有细胞病理学诊断证据，入组的患者KPS评分大于60分;其中男性17例，女性14例;年龄56-78岁，平均63.5岁;组织学类型为鳞癌10例，腺癌17例，腺鳞癌4例。患者均有影像学检查证实合并有骨、肾上腺、肝脏或肺等脏器单发或多发转移灶，所有患者治疗前均放弃放化疗治疗，并签署治疗知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 入选患者均选取靶向药物吉非替尼治疗，治疗前晨取患者静脉血2 ml，枸橼酸钠抗凝处理，-70℃低温冰箱保存。所有患者口服吉非替尼250 mg/次，1次/d，直到肿瘤进展或患者不能耐受药物不良反应而终止治疗。服药时间最短1个月，最长13个月。所有患者吉非替尼治疗期间不采用其他的抗肿瘤治疗。

1.2.2 外周血游离DNA的提取 采集患者治疗前外周静脉血4 ml，室温放置2 h后用低温高速离心机将静脉血离心(20 ℃，3 000 r/min，10 min)，弃下液，取上层液血浆1 ml放置入2 ml冻存试管，血清DNA以磁珠法全血基因组DNA抽提试剂盒(美国Omega公司生产)抽提，按说明书所述的方法抽提血清DNA。

1.2.3 外周血游离DNA中EGFR基因突变的检测 DNA抽提完成后进行PCR扩增目的片段EGFR，EGFR外显子19上游引物:5'-AACGTCTTCTCCCTTCTCTCTCTGTCA-3'，下游引物:5'-C CACACAGCA AAGCAGAAACT-3'，产物大小为150 bp;EGFR外显子21上游引物:5'-TCTTCTCGTTTT CAGGGC ATG-3'，下游引物:5'-GGCTGACCTAAAGCCACCTC-3'，产物大小为196 bp;PCR扩增体系设计为 20 μl，模板 1 μl。扩增外显子为 l9、2l外显子。扩增步骤:①95℃，5 min变性;②95℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃ 45 s，40 个循环;③72 ℃ 延伸7 min。扩增产物经1.6%琼脂糖凝胶电泳100 V 30 min后EB染色摄片。对观察到阳性扩增条带的样本分离纯化后进行基因测序，测序引物采用各外显子的上游引物。

1.2.4 疗效评价标准 根据WHO疗效评价标准，口服吉非替尼疗效分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)和进展(PD)，CR和PR要在距离首次评价至少4周后再次确认，计算有效率(RR)和疾病控制率(DCR)。定期复查胸部CT、头颅CT、腹部B超及全身同位素骨扫描，进行疗效判定。吉非替尼治疗开始后前3个月每月随访评估疗效，以后每2个月评估1次。随访终止时间2015-02-01。

1.3 统计学处理

应用SPSS 10.0软件进行统计分析，检验水准α=0.05(双侧)，采用确切概率法对计数资料进行检验，比较两组患者吉非替尼治疗后的RR、DCR，采用Kaplan-Meier分析两组患者PFS差异，均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR基因突变与吉非替尼疗效关系

31例患者采样时首次接受吉非替尼治疗，治疗前均未接受放化疗，应用RT-PCR方法检测出的外周血游离DNA中EGFR突变率为41.9%(13/31)，患者根据检测结果分组，EGFR野生型患者18例(其中有10例患者虽然未检测到EGFR基因突变，经患者要求并签署知情同意书后给予吉非替尼治疗，作为对照组)，突变型患者13例。评估吉非替尼对晚期NSCLC患者治疗结果显示，EGFR突变型患者的有效率为 61.5%(8/13)，疾病控制率为69.2%(9/13);EGFR野生型患者的客观缓解率为10.0%(1/10)，疾 病 控 制 率 为 10.0%(1/10)。EGFR基因突变型患者疗效优于野生型，对两组患者治疗效果进行统计学分析表明差异具有显著性(P＜0.05，见表1)，提示外周血游离DNA检测EGFR基因突变结果可以作为临床应用靶向药物治疗的重要依据。

2.2 预后

根据随访计划，EGFR基因突变组患者中位无进展生存时间(PFS)为14个月，1年生存率为75.0%，2年生存率为30.7%;而EGFR基因野生组患者中位无进展生存时间(PFS)为7.5个月，1年生存率为20.0%，2年生存率为0，两组间生存率及PFS比较差异具有统计学意义(P=0.004 2，见图1)，提示根据外周血EGFR基因突变状况指导临床靶向药物治疗，可以明显改善患者的预后。

表1 EGFR突变组与野生组RR、DCR的比较 例(%)Table 1 Comparison of RR，DCR between wild type and mutation group cases(%)

图1 Kaplan-Meier分析两组患者PFS生存曲线Figure 1 Kaplan-Meier survival curves of progression-free survival of patients with or without EGFR mutations

2.3 吉非替尼治疗的不良反应

吉非替尼出现不良反应主要有皮疹、腹泻、转氨酶升高、恶心、呕吐、白细胞减少及间质性肺疾病等。入组患者中最常见为痤疮样皮疹，发生率为39.1%(9/23)，皮疹表现为Ⅰ-Ⅱ度;其次为皮肤瘙痒，发生率为13.0%(3/23)，均为Ⅰ度，给予抗组胺药物治疗后症状缓解，入组患者中口服吉非替尼后未出现腹泻、转氨酶升高、恶心、呕吐、白细胞减少或间质性肺疾病等不良反应，无因不良反应而导致药物减量或停药者。

3 讨论

表皮生长因子受体(EGFR)是目前抗癌药物研究领域中最受瞩目的靶点分子之一，其主要通过特异地、竞争性地与EGFR激酶功能区的ATP结合位点结合，抑制其激酶活性从而阻断和癌细胞增殖、转移等相关的信号传导。与传统的化疗药物相比，靶向药物克服了一般化疗药物常见的毒副作用，尤其是骨髓抑制作用及胃肠道反应。目前临床应用的EGFR抑制剂主要包括吉非替尼、厄洛替尼，主要用于非小细胞肺癌患者的治疗［7-9］，而EGFR基因的突变状态是厄洛替尼及吉非替尼疗效的有效预测指标，大量的临床研究表明［10-12］，对于存在EGFR基因突变的肺癌患者，尤其对于亚洲、女性及不吸烟的肺腺癌患者，吉非替尼及厄洛替尼在肺癌的治疗中显示出良好的临床疗效，且不良反应轻。

现有EGFR基因的检测均需采用手术切除或活检肿瘤组织，而对于不具备手术指征的中晚期NSCLC患者而言，临床由于缺乏足够的组织标本而无法检测患者EGFR基因的突变状态。肿瘤患者血清游离DNA的来源主要是肿瘤组织中癌细胞凋亡后，癌细胞内的DNA释放入人体外周血或癌细胞在体内循环中坏死、凋亡，其中的DNA释放到外周血。经癌组织来源的循环DNA，其遗传特性与肿瘤基因组DNA相同［13，14］。因而通过检测血清游离 DNA中的EGFR基因，可以间接反映肿瘤组织EGFR基因的突变情况，从而为临床应用靶向药物治疗提供依据。

近年来，国内已有利用外周血检测EGFR突变指导靶向药物治疗的报道，周小昀等［15］应用EGFRTKIs治疗的有效率高达83%，而马玲等［16］应用EGFR-TKIs治疗有效率为55.6%。在本组研究中，31例患者应用RT-PCR方法检测出的外周血游离DNA中EGFR突变率为41.9%，入组的患者中有10例未检测到EGFR基因突变接受了吉非替尼治疗，有EGFR基因突变的13例患者均接受吉非替尼治疗，治疗结果显示，EGFR突变型患者的有效率为61.5%，疾病控制率为69.2%，PFS为14个月，1年生存率为75.0%，2年生存率为30.7%;而EGFR野生型患者的客观缓解率为10.0%，疾病控制率为10.0%，PFS为7.5个月，1年生存率为20.0%，2年生存率为0，再次表明外周血EGFR基因突变型患者接受吉非替尼治疗其疗效优于野生型，可以明显改善患者的预后，本研究中接受吉非替尼治疗的有效率与已有的报道存在一定的差异，考虑与入组患者的例数较少、实验方法及病例病理分型不同等因素有关。另外，EGFR野生型患者中出现1例吉非替尼治疗有效，考虑可能与采样的外周血中提取到的游离的DNA较少，导致EGFR基因检测结果出现假阴性。在所有接受吉非替尼治疗的患者中最常见的不良反应为痤疮样皮疹，其次为皮肤瘙痒，症状较轻，给予对症治疗后症状均可缓解，无因不良反应而导致药物减量或停药者。

本研究结果表明，外周血游离DNA中EGFR基因突变检测结果可以为肺癌患者靶向治疗提供指导作用，对于无法获取组织学检测的肺癌患者具有重要的意义，而且采集患者外周血比较方便，患者痛苦少易于接受，该项技术值得临床推广。

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