GSK-3β在胃癌中的表达及其与5－氟尿嘧啶、顺铂药物敏感性之间的关系

刘 洋，梁建芳，郑绘霞(山西医科大学基础医学院病理学教研室，太原 03000;山西医科大学第一临床医学院病理科;通讯作者，E-mail:huixiazheng6@63.com)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是消化系统常见的恶性肿瘤，在我国其发病率呈逐年上升的趋势。辅助化疗是胃癌综合治疗的重要组成部分，但在临床实践中由于肿瘤患者个体差异的存在，以及获得性耐药的产生，导致其临床疗效不甚理想，如何客观地选择有效的药物进行个体化治疗是亟待解决的问题。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，除参与糖代谢外，还与细胞生长、增殖和凋亡等多种生理过程密切相关［1］。此外，GSK-3β 在多种肿瘤中异常表达［2-4］，并且与化疗药物的耐药性有关［5］。本研究对50例胃癌新鲜组织中GSK-3β的表达进行检测，并分析了不同药物敏感/耐药与GSK-3β表达的关系，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集山西医科大学第一医院普外科2014-02～2014-11住院手术治疗胃癌新鲜标本50例及癌旁组织(距肿瘤组织大于5 cm)，一部分用于细胞原代培养，一部分立即冻存于低温冰箱用于Western-blot实验。所有患者术前未经放化疗，术后经病理诊断为胃腺癌。50例患者中，男性34例，女性16例;年龄42-73 岁，平均年龄(55.6 ±11.3)岁。

1.2 主要试剂、药品及仪器

噻唑蓝MTT、二甲基亚砜DMSO(美国Sigma);1640培养基(美国GIBCO);胎牛血清、双抗液(美国Hyclone);5-氟尿嘧啶、顺铂(齐鲁制药有限公司);二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo Fisher);酶标仪(日本BIO-RAD);电泳仪(北京六一);转膜仪、凝胶成像仪(上海Tannon);GSK-3β一抗(美国Santa Cruz)，GAPDH一抗(武汉博士德生物公司)。

1.3 胃癌细胞原代培养

取手术切除的新鲜胃癌标本，剔除周围坏死糟碎组织后称取1 g。双抗液反复冲洗数次后将肿瘤组织剪碎至直径1 mm3大小碎块，尽量至稀糊状，加入5 ml消化酶，37℃孵育1 h，震荡混匀并通过200目滤网，收集滤液，1 000 r/min离心10 min，弃去上清。台盼蓝计数，调整细胞浓度至1×105/ml，接种于96孔板中，用含10%血清的1640培养基于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.4 MTT 实验检测

细胞生长至指数增长期进行MTT药敏实验，5-氟尿嘧啶、顺铂药物终浓度为血药峰值浓度(5-FU 35.0 μg/ml，DDP 4.6 μg/ml)，每组设 6 个平行孔，另设调零组(无细胞，加200 μl培养基)及对照组(不予任何药物干预)。培养48 h后，每孔加入MTT液20 μl(浓度5%)，继续培养4 h后，吸去上清，每孔加150 μl DMSO，室温轻摇5 min，立即置于酶标仪测定490 nm波长下吸光度值(A)。计算细胞生长抑制率(IR)，IR(%)=1-试验孔A均值/对照孔 A均值 ×100%。按照实体瘤体外敏感标准［6］，抑制率＞30%定为敏感，＜30%定为耐药。

1.5 Western blot检测

电子天平称取0.2 g肿瘤新鲜组织及癌旁组织，置于EP管中尽量剪碎，加入组织裂解液提取蛋白。常规提取蛋白，分光光度计检测OD值，标准曲线法计算蛋白含量。常规制备8%SDS-PAGE凝胶，蛋白电泳(100 V，50 min)。湿转法转移至硝酸纤维素膜(100 V，40 min)，蛋白干粉封闭，滴加一抗(GSK-3β 浓度1∶600，GAPDH 浓度 1∶1 000)4 ℃冰箱孵育过夜，二抗(浓度1∶3000)室温孵育1 h，ECL法成像，Tannon成像仪摄片。对显影条带进行灰度分析，计算目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 GSK-3β在胃癌及癌旁组织中的表达

与癌旁正常组织(0.868 0 ±0.079 1)相比，GSK-3β在胃癌组织中的表达明显降低(0.4286±0.0929)，差异有统计学意义(t=7.199，P=0.000，见图 1)。在胃癌组织中GSK-3β的表达与患者的年龄、分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关(P＜0.05)，与患者性别无关(P ＞0.05，见表1)。

2.2 胃癌对5-氟尿嘧啶、顺铂的体外药物敏感性检测及其与GSK-3β蛋白表达的关系

图1 GSK-3β在胃癌及癌旁组织中的表达Figure 1 Expression of GSK-3β in gastric carcinoma and paracancerous specimens by Western blot

表1 GSK-3β蛋白的表达与临床病理参数之间的关系Table 1 Correlation between GSK-3β protein expression and clinicopathological featuress

50例胃癌标本最终39例成功进行了原代培养及药物敏感性测定，可评价率为78.0%。按照不同药物的体外抑制率进行评价，最终39例胃癌患者对5-FU敏感者14例，耐药者25例，对DDP敏感者10例，耐药者29例，见表2。39例成功进行药敏检测的胃癌病例中，对DDP及5-FU耐药组织GSK-3β蛋白的表达量低于敏感组织，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图 2，表3)。

表2 胃癌患者对5-FU、DDP体外敏感及耐药情况 (例)Table 2 Sensitivity and drug-resistance of 5-FU and DDP to gastric carcinoma (cases)

图2 GSK-3β蛋白的表达与DDP及5-FU药物敏感性的关系Figure 2 Correlation between GSK-3β protein expression and sensitivity and drug-resistance of 5-FU and DDP to gastric carcinoma

表3 GSK-3β蛋白的表达与药敏实验的关系Table 3 Correlation between GSK-3β protein expression and sensitivity and drug-resistance of 5-FU and DDP to gastric carcinoma

3 讨论

GSK-3β结构特殊，功能广泛，其表达异常或者活性改变可影响多种病理生理过程。在肿瘤中的研究表明，GSK-3β 主要通过参与 Wnt/β-catenin，PI3K/Akt等信号通路发挥作用，通过磷酸化/去磷酸化进行活性调节。由于GSK-3β信号转导极为复杂，受细胞类型和内环境等因素影响，因此在肿瘤中具有双向调节作用，例如，GSK-3β既可以通过调节p53基因水平促进细胞凋亡、抑制细胞生长，也可通过维持 NF-κB水平抑制细胞凋亡、促进细胞生长［7］。现有的报道显示，在不同的肿瘤中 GSK-3β的表达功能不一，例如在卵巢癌中GSK-3β的活化促进细胞增殖［8］，而在乳腺癌中GSK-3β的活化抑制细胞增殖［9］。目前GSK-3β在胃癌中的相关研究报道较少。

本研究首先对胃癌组织及癌旁正常组织进行了定量分析，结果表明，癌组织中GSK-3β蛋白的表达水平较癌旁正常组织明显下调，说明GSK-3β低表达可能促进了胃癌细胞的增殖，与胃癌的发生密切相关。在50例胃癌中，GSK-3β的表达与患者的性别无显著关系，而在分化程度低、TNM分期高以及淋巴结发生转移的癌组织GSK-3β表达更低，提示GSK-3β可能与胃癌的恶性程度及预后相关，这与杜维等学者的免疫组化结果相一致［10］。就可能的机制而言，Zheng等认为GSK-3β在胃癌组织中的低表达促进 APC/Axin/GSK-3β/β-catenin复合物的解聚，从而导致β-catenin在核内的积聚与活化，参与胃癌的发生和浸润转移［11］。Thiel等的研究则表明，GSK-3β活性下降可导致环氧合酶2(COX-2)活性升高，从而促进胃癌的发生发展［12］。此外，本研究小于55岁的患者癌组织中GSK-3β的表达水平高于55岁以上患者，我们认为可能与年龄的增长引起的机体物质代谢功能下降有关。

除了对肿瘤细胞进行调节之外，GSK-3β还可能参与了化疗药物的耐药过程。在顺铂耐药肺腺癌A549/DDP细胞中，磷酸化GSK-3β水平显著升高，提示GSK-3β活性受到抑制可能是非小细胞肺癌顺铂耐药的原因［13］。结肠癌中，GSK-3β通过细胞质/核迁移的方式参与并促进了5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡［14］。本研究50例胃癌新鲜组织最终39例成功进行了原代培养及胃癌基础化疗药5-氟尿嘧啶、顺铂MTT药敏实验，可评价率较高(78.0%)，按照癌细胞对不同化疗药体外的抑制率，我们将其分为敏感和耐药两组，结果显示GSK-3β在两种药物敏感组中的表达水平均明显高于耐药组，提示在胃癌中GSK-3β的活性下降可能与5-氟尿嘧啶及顺铂的耐药有关。目前GSK-3β参与化疗药物耐药的具体机制尚不明确，较为一致的观点是其通过上调耐药相关蛋白发挥作用:GSK-3β活性下调后细胞内P-糖蛋白的浓度显著升高［15］，而P-糖蛋白可将胞内化疗药物泵至胞外，使得胞内达不到有效浓度。抑制GSK3β的表达还可以稳定β-catenin蛋白，通过活化MDR1(多药耐药基因1)启动子上调MDR-1蛋白的表达介导耐药［16］。此外，GSK-3β的耐药作用还可能与P53、NF-κB通路介导的细胞凋亡有关。

综上所述，在胃癌中GSK-3β表达水平下调，该作用可能与胃癌的发生、发展及耐药相关，有望成为胃癌个体化治疗的有效靶点。

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