洋葱内表皮细胞中DNA和RNA染色方法的改进

陈小辉，胡 乐，柯志勇，杨翠兰，马 宁(南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室，广州 510515;通讯作者，E-mail:276072029@qq．com)

教学与科研中常用于显示细胞内DNA和RNA的染色方式为甲基绿－派洛宁染色法［1］。本科实验教学中的《细胞中DNA和RNA的染色观察》实验通常开展“洋葱内皮细胞内DNA和RNA的分布”。在本科教学中，我们发现此染色法的效果与实际效果相差较大，同时甲基绿与派洛宁的浓度比为5∶2时，染色过程中没有对洋葱内皮细胞进行固定，但是实验结果经常出现细胞核呈现紫红色而非蓝绿色，洋葱内皮细胞容易出现质壁分离，相邻细胞出现很大染色差异等现象。本研究主要通过探索甲基绿与派洛宁的合适浓度配比，同时寻找合适的固定液，从而获得更好的实验效果。

1 材料与方法

1．1 材料

新鲜洋葱。试剂:甲基绿、派洛宁Y(购自广州威佳科技有限公司)，无水乙醇、甲醇、冰醋酸、醋酸钠(购自南方医科大学试剂中心)。

1．2 试剂配制

醋酸盐缓冲溶液(pH 4．8):冰醋酸 2．4 ml，醋酸钠8．16 g，蒸馏水498 ml混合后配制成0．2 mol/L的醋酸盐缓冲溶液［2］。

甲基绿派洛宁混合染色液的配制:甲基绿粉末8 g，溶于醋酸盐缓冲溶液400 ml，配制成2%甲基绿染色液。派洛宁粉末8 g，溶于醋酸盐缓冲溶液400 ml，配制成2%派洛宁染色液。配制2%甲基绿溶液2%派洛宁溶液的体积比为 5∶2、2∶1、3∶2 和 1∶1 的混合染液。

甲醇冰醋酸固定液:甲醇300 ml，冰醋酸100 ml混匀后配制成固定液［3］。

1．3 实验步骤

①取材:用镊子取新鲜洋葱的内表皮约0．5 cm2，置于载玻片上，分为 5∶2，2∶1，3∶2 和 1∶1 四个浓度组。②固定:滴1－2滴甲醇冰醋酸固定液于洋葱标本上，固定5 min。③染色:吸干多余的固定液，各组对应滴加两滴各自浓度的甲基绿派洛宁混合染色液。染色5 min。④冲洗:在自来水下用缓慢的流水冲洗，充分洗去浮色，直至所流下来的水为无色。⑤盖片观察:用吸水纸吸干水分，盖上盖玻片，置于镜下观察。改进前后实验步骤详见表1。

表1 改进前后洋葱内皮细胞内DNA和RNA染色法的实验步骤Table 1 The experimental steps of DNA and RNA staining in onion epidermal cells before and after improvement

2 结果

改进前未固定而染色的细胞绝大部分发生严重质壁分离，在实验过程中发现多数细胞着色深浅不一，部分细胞质也呈现蓝绿色。固定后染色的细胞着色良好，极少发生质壁分离，染色时间短。四个浓度中3∶2和1∶1的洋葱内表皮细胞的着色情况较好，细胞质被派洛宁染成红色较明显，并且能清楚观察到红色的核仁，细胞核被甲基绿染成蓝绿色。浓度为5∶2和2∶1的细胞经过染色后细胞质也被染成红紫色，与细胞核对比不明显，也不能清楚观测到核仁。染色结果详见图1。

图1 不同条件下洋葱内表皮细胞染色观察Figure 1 Observation on dyeing of onion epidermal cells under different conditions

3 讨论

由于甲基绿－派洛宁染色法一般用于定性分析，所以它的染色过程并未统一，不同研究人员使用的条件也不一样。文献中曾出现多种染色方法，有学者在染色之前通过8%HCL溶液中解离洋葱内表皮细胞，可以达到较好的染色效果［4］，但是盐酸冲洗不净会影响pH值，对后续染色产生不利影响，以及烘干、水解操作中存在安全隐患［5］，不适用于教学。

本研究对细胞中DNA和RNA染色方法的改进是增加了对洋葱内表皮细胞的固定。甲醇冰醋酸固定液是细胞培养教学中最常用的染色固定液，通过固定能使细胞失活，能够防止质壁分离，并且使其通透性增强，减少染色时间，能达到较好的染色效果;其次因其能迅速挥发，固定后无需漂洗，从而节省时间。

本实验在操作时采用过两种品牌的甲基绿、派洛宁Y染液，在实验中我们发现，两种染色液在浓度配制时分别表现出不同的最适宜浓度，但均位于3∶2至1∶1之间。原因可能是不同公司提供的甲基绿、派洛宁Y试剂纯度不尽相同，实验教学前需要任课老师做预实验，找到合适的配制比例。

在实验过程中应注意以下几方面:①取材时注意区分洋葱内表皮的光滑面和叶肉面，将取好的洋葱内表皮叶肉面向下平铺于载玻片上。②固定液从洋葱内表皮边缘处滴加，用镊子轻轻移动洋葱内表皮，通过虹吸，使洋葱内表皮的叶肉面充分接触固定液，固定5 min后可用镊子将洋葱内表皮轻轻夹起来，自然风干。③染色液从洋葱内表皮边缘处滴加，用镊子轻轻移动洋葱内表皮，使洋葱内表皮漂浮在染色液上，洋葱内表皮的叶肉面充分接触染色液，染色过程中用镊子轻轻移动洋葱内表皮，使其染色充分。

［1］胡敏，肖纯．显示细胞DNA和RNA的甲基绿－派洛宁技术的改进［J］．江西中医学院学报，2005，17(1):66－67．

［2］罗深秋，刘建中．医学细胞生物学实验指导及复习思考题［M］．北京:科学出版社，2012:19－21．

［3］程宝鸾．动物细胞培养技术［M］．广州:中山大学出版社，2009:122．

［4］ 何娇．DNA和RNA在细胞中的分布情况观察［J］．热带农业工程，2012，36(1):8－12．

［5］孟希．观察DNA和RNA在细胞中分布实验的优化［J］．生物学教学，2013，38(5):62．