俄罗斯卡尔梅克共和国酸奶油中乳酸菌的多样性分析

张哲，徐海燕，于洁

（1呼和浩特市第二中学，呼和浩特010090，2.内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

0 引言

传统食品的制作和食用已历经数千年，各个国家和民族几乎都有自己独特的传统发酵乳制品，因其品种丰富、味道鲜美、营养价值高而备受世界各国人民的青睐。俄罗斯卡尔梅克人在制作传统发酵乳制品也有着丰富的经验和悠久的历史。俄罗斯卡尔梅克的传统发酵乳制品的种类主要包括：酸奶，酸奶油，奶渣、奶酪、开菲尔乳和马奶酒等[1]。其中，酸奶油作为一种传统发酵乳制品，色泽乳白，风味独特，香浓可口，广泛地被用于菜肴的烹饪和各类糕点的烘焙，它使各式菜倄多了一种奶香味，地位非常重要，就像中菜的酱油[2]。

酸奶油制作主要是经过乳酸菌的发酵过程实现的，其中蕴含着丰富的乳酸菌资源。乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）是一群形态代谢性能和生理学特征不完全相同的能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌总称[3]。由于乳酸菌具有改善肠道菌群、增强人体免疫力、抗肿瘤、降低血液胆固醇、降血压等功能而呈现出极大的开发利用价值[4,5]。因此，随着乳酸菌产业进一步的发展，传统发酵乳制品中的乳酸菌资源的开发和群落结构分析逐渐成为研究的热点。

本研究以俄罗斯卡尔梅克共和国3个地区采集的6份酸奶油样品为研究对象，采用MRS培养基来分离其中的乳酸菌，利用16S rRNA基因序列分析法对乳酸菌进行分类鉴定，依据乳酸菌种类和数量分析酸奶油中的乳酸菌多样性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源。

本试验所用的6份酸奶油样品是由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室的研究人员于2012年9月14日-2012年9月20日，在俄罗斯卡尔梅克共和国的3个地区采集到的。酸奶油样品的具体信息见表1。

表1 俄罗斯卡尔梅克共和国地区酸奶油的来源及乳酸菌活菌数

1.1.2 主要试剂与仪器。

MRS固体培养基（DifcoTM Lactobacilli MRS Agar，BD），MRS肉汤培养基（Man Rogosa Sharpe broth，Oxide），EasyTaq DNA polymerase、dNTPs（每种2.5 mmol/L）等PCR试剂均购于北京全式金生物技术有限公司，引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成；PCR基因扩增仪（Applied Biosystems），Eppendorf 5810R冷冻离心机，CDS8000型UPV凝胶成像分析系统，ND-1000型微量紫外分光光度计等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

先将容器中的酸奶油充分搅拌，用带有灭菌吸头的移液器吸取1.5 mL样本放入装有灭菌中和剂（淀粉/CaCO3，50：1，M/M）的无菌2.0 mL螺口冻存管中，混匀后用封口膜封口后标记样品号，放入4℃便携式冰箱内保持低温度状态，带回实验室后，尽快进行微生物组成分析和乳酸菌的分离的实验。

1.2.2 酸奶油中乳酸菌活菌计数

采用倾注法对样品中的乳酸菌进行活菌计数。将样品用漩涡振荡器混匀后，吸取0.5 mL样品于4.5 mL的灭菌生理盐水（0.85%，w/w）中，以10倍稀释法进行梯度稀释，吸取1 mL稀释度为10-5、10-6、10-7的稀释液置于塑料培养皿中（d=9 cm）中，立即倒入约20 mL含有10 ppm放线菌酮和硫酸多粘菌素的MRS固体培养基（温度为70℃左右），迅速摇匀，待完全凝固后置于30℃恒温培养箱中厌氧培养48 h。

1.2.3 乳酸菌的分离

用灭菌枪头吸取1.2.2中所述稀释度为10-5、10-6、10-7的稀释液各200μ L，分别涂布于MRS平板 培 养 基 上，厌氧条件下30℃培养48～72 h，菌落形成后观察菌落形态，依据菌落大小、颜色、光泽度、凸起度等差异，将所有形态特征不同的菌落做标记，并在无菌条件下将标记好的菌落接种于MRS液体培养基中，30℃厌氧培养24 h。继续传代后挑取适量菌体进行革兰氏染色试验（涂片、固定、染色、脱色）和过氧化氢酶试验。最终，将革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的无芽孢的杆状或球状的菌株保存用于后续的实验。

1.2.4 乳酸菌的鉴定

1.2.4.1 乳酸菌全基因组的提取。

采用液氮反复冻融-CTAB法提取分离株的基因组DNA,具体步骤参考见文献[6]。将提取的基因组原液采用琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测其质量和浓度。

1.2.4.2 乳酸菌16S rRNA基因扩增。

将上述制备的基因组DNA作为模板采用50μ L体系进行扩增。扩增引物为：FA-27F：5-gcagagttctcggagtcacgaAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，RA-1495R：5-agcggatcacttcacacaggaCTACGGCTACCTTGTTACGA-3[7]。扩增循环为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，58 ℃1 min，72 ℃2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，若PCR成功则在1500 bp左右可见清晰的条带。

1.2.4.3 16S rRNA基因序列的测定及系统发育树的构建。

将PCR产物送到上海美吉生物技术有限公司进行双向测序，每株菌获得两条16S rRNA基因的序列，运用DNAStar 6.1软件包中的SeqMan软件将其进行拼接，最终获得1300bp-1400bp的有效序列。利用NCBI（National Center for Biotechnology Information）中的 Blast软件 BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），将测定的序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知分类地位的乳酸菌16S rRNA基因序列进行同源性比较。应用软件Mega 6.0中的Cluster W将模式菌株和所测菌株的16S rRNA基因序列进行多重序列比对，在此基础上采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树[8]。最后将所有测序菌株的16S rRNA基因序列上传至GenBank数据库中。

2 结果与分析

2.1 酸奶油中乳酸菌的活菌数及分离结果

俄罗斯卡尔梅克地区采集的6份酸奶油样品中乳酸菌活菌数在7.30～8.62 lg cfu/mL间（见表1），均值为8.12±0.46 lg cfu/mL。这表明酸奶油中的乳酸菌资源较丰富。

根据菌落形态特征、革兰氏染色和过氧化氢酶试验，6份样品中共分离到28株乳酸菌。菌株在MRS培养基上呈现出边缘整齐或呈锯齿状、中央突起、表面光滑或粗糙的白色、褐色或透明菌落。革兰氏染色后杆菌的细胞形态有粗短、粗长、细长、细短形，少量为弯曲状；球菌为圆形或椭圆形，成对、链、簇状球排列。

2.2 乳酸菌16S rRNA基因序列鉴定结果

液氮冻融-CTAB法提取的乳酸菌基因组DNA大小在23 Kb左右，浓度和纯度均满足后续实验要求。采用引物FA-27F和FR-1495R对乳酸菌分离株16S rRNA基因进行了扩增。经琼脂糖凝胶电泳检测后，可以观察到在1500 bp的位置处有一条清晰明亮的条带，无弥散和非特异扩增现象，如图1所示。

图1 16S rRNA基因的PCR扩增产物电泳图

将拼接完成的16S rRNA基因序列通过BLAST与数据库中的菌株进行同源性比较，如果同源性大于99%则可将其直接鉴定到种的水平。从每个种中挑取一株有代表性菌株的16S rRNA基因序列与模式菌株的序列利用软件Mega 6.0构建系统发育树，Bacillus subtilis NCDO 1769作为外源菌种，Bootstrap值设定为1000。10株乳酸菌16S rRNA基因系统发育树见图2。

图2 10株乳酸菌代表菌株和模式菌株的16S rRNA基因系统发育树

从图中可以看出，菌株IMAU90217和IMAU90063分别与Lactobacillus brevis ATCC14869、Lb.plantarum ATCC 14917的距离最近，且同源性达到99%以上，故被鉴定为L.brevis和L.plantarum。菌株IMAU90078与Lb.paracasei ATCC25302的亲缘关系最近，而且它们的同源性为100%，因此可将其归为Lb.paracasei。菌株IMAU90064和IMAU90219分别与乳球菌属的模式株Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 19435和Lac.lactis subsp.cremoris ATCC 19257亲缘关系最近，同源性分别为100%，故将它们分别鉴定为Lac.lactis subsp.lactis和Lac.lactis subsp.cremoris。在链球菌属这一分支上，IMAU90031与Streptococcus hermophilus ATCC19258聚为一类，且其同源性均为99%以上，故鉴定为Streptococcus thermophilus。菌株IMAU90003、IMAU90002、IMAU90232和IMAU90153分别与明串株菌属中的模式株Leuconostoc citreum ATCC 49370、Leu. lactis ATCC19256、Leu. pseudomesenteroides ATCC12291和Leu.mesenteroides ATCC8293的亲缘关系最近，且它们之间的同源性均大于99%，可判定其分别为Leu.citreum、Leu.lactis、Leu.pseudomesenteroides和Leu.mesenteroides。

通过分离株的16S rRNA基因同源性比较及系统发育树分析，结果表明，分离自俄罗斯卡尔梅克共和国的酸奶油中的28株乳酸菌鉴定为4个属（Lactobacillus，Lactococcus，Leuconostoc和 Streptococcus）中的 10 个种，包括Lb.brevis（1株）、Lb.paracasei（1株）、Lb.plantarum（5株）、Lac.lactis subsp.lactis（2株）、Lac.lactis subsp.cremoris（5株）、Leu.citreum（1株）、Leu.lactis（3株）、Leu.mesenteroides（5株）、Leu.pseudomesenteroides（4 株）和S.thermophilus（1株）。具体鉴定结果和16S rRNA基因序列登录号见表2。

3 讨论

由于传统发酵乳制品具有诸多益生保健功能，使得越来越多的研究学者致力于传统发酵乳制品中乳酸菌菌群结构的研究。本研究中通过对俄罗斯卡尔梅克地区的酸奶油中乳酸菌的活菌计数和分离鉴定，证实了其中蕴含着丰富的乳酸菌资源，且种类较多。其中明串菌属（Leuconostoc）是俄罗斯卡尔梅克地区的酸奶油中优势乳酸菌菌属，占总分离菌数的50%。此外，Lb.plantarum和Lac.lactis subsp.lactis的分离株也较多。2009年，Idoui[9]等从阿尔及利亚东部地区的传统奶油中分离出26株乳酸菌，它们被鉴定为三个属Lactococcus，Leuconostoc和 Lactobacillus，其中 Lactococcus lactis subsp.diacetylactis是奶油中的优势菌群。2006年，Mourad[10]对阿尔及利亚撒哈拉地区的20份传统奶油（shmen）进行微生物构成研究，结果表明分离出的181株乳酸菌鉴定为Lactobacillus plantarum（40株），Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus（35株），Lactococcus lactis subsp.lactis（22 株），Lactococcus lactis subsp.cremoris（18株）和Lactobacillus paracasei（10株）。通过与其它地区传统奶油中乳酸菌的研究相比，俄罗斯卡尔梅克地区的酸奶油中的乳酸菌的种类和比例具有明显的地域特点，我们推断这可能与酸奶油的制作工艺、产地的环境气候等因素有关。

表2 酸奶油中乳酸菌的种类及16SrRNA基因序列登录号

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