急性缺氧对环匹阿尼酸诱导的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度升高的影响

彭公永，胡国平，赵祝香，胡锦兴，邹义敏，彭芳

急性缺氧对环匹阿尼酸诱导的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度升高的影响

彭公永，胡国平，赵祝香，胡锦兴，邹义敏，彭芳

急性缺氧；环匹阿尼酸；肺静脉平滑肌细胞；细胞内Ca2+浓度；钙池操纵性钙通道

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:800.)

在肺循环中，肺静脉不仅仅是毛细血管氧合后的血流入左心房的通道，而且参与调节肺泡壁毛细血管的充盈和复张，并和肺动脉一起参与调节肺通气/灌注，肺动脉和肺静脉的收缩均可导致肺血管阻力升高。尽管肺静脉具有生理重要性，但肺静脉的收缩反应较少受到关注，肺静脉及肺静脉平滑肌细胞（PVSMC）的缺氧性变化尚未引起重视。以往实验表明：急性缺氧可导致包括大鼠、绵羊、雪貂、猪、狗等多种动物肺静脉的强烈收缩[1,2]，但其具体机制尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

Ⅰ型胶原酶、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、氯化钙（CaCl2）、硫酸镁（MgSO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、碳酸氢钠（NaHCO3）、CPA、氯化镍（NiCl2）、SKF 96365、葡萄糖、硝苯地平（美国Sigma公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清、DMEM培养基（美国Gibco公司）；Fura-2 AM（美国Invitrogen公司）；显微镊、显微剪（上海金钟公司）；体式显微镜、荧光显微镜（日本Nikon公司）；细胞内钙浓度检测系统（美国Intracellular Imaging公司）；双通道温度控制系统（美国Warner Instrument公司）。

1.2 大鼠远端肺静脉平滑肌细胞原代培养

采用笔者已经报道的方法[6-8]，6只雄性SD大鼠（体重200～250 g）腹腔注射2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉后，开胸取心、肺，于体式显微镜下用显微镊和显微剪分离远端肺静脉（4级分支以下），用Ⅰ型胶原酶消化法原代培养并鉴定大鼠远端PVSMC。

1.3 细胞内钙浓度测定

参照文献[6-8]，PVSMC生长至50%～60%融合，用5 μmol/L Fura-2 AM 37℃避光负载细胞1 h，固定长有细胞的盖玻片于荧光显微镜上的观测盒内，以0.5～1 ml/min的流速用Krebs溶液（含118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、2.5 mmol/L CaCl2、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）灌流孵育细胞15 min，以含16%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡Krebs灌流液，用双通道温度控制系统控制观测盒温度37～37.2℃，打开荧光显微镜和细胞内钙浓度检测系统，实时记录数据。

1.4 急性缺氧对环匹阿尼酸诱导的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度升高的影响

实验分常氧组和缺氧组。两组细胞先分别用16%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡的Krebs溶液灌流孵育5 min，然后，常氧组先用16%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平（电压依赖钙通道阻断剂）无钙Krebs液（118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）孵育10 min，再用16%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平的Krebs液孵育15 min，缺氧组先换用4%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡的含10 μmol/L CPA、5μmol/L硝苯地平无钙Krebs液孵育10 min，再用4%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min，最后，两组细胞分别用16%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡Krebs液孵育10 min。

1.5 氯化镍、SKF96365对急性缺氧作用的干预

NiCl2和SKF96365均为SOCC阻断剂。实验分对照组、NiCl2干预组和SKF96365干预组。三组细胞先分别用16%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡的Krebs溶液灌流孵育5 min，对照组先以4%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡的含10 μmol/L CPA、 5 μmol/L硝苯地平无钙Krebs液孵育10 min，再以4%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min；而NiCl2干预组和SKF96365干预组在相同时相的灌流液中分别加入500 μmol/L NiCl2和50 μmol/L SKF96365，其余处理与对照组相同，最后，各组均以16%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡Krebs液孵育10 min。

1.6 氯化镍、SKF96365对高钾引起的肺静脉平滑肌细胞内钙浓度升高的影响

参照文献[9,10]，实验分对照组、NiCl2干预组和SKF96365干预组。各组细胞先用16%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡的Krebs液孵育5 min，然后用16%O2、5%CO2的混合氮气持续平衡的高钾Krebs液（60 mmol/L KCl、60 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）孵育10 min，NiCl2干预组和SKF96365干预组在相同时相灌流液中分别加入500 μmol/L NiCl2和50 μmol/L SKF96365，其余处理与对照组相同，最后，三组细胞分别用Krebs液孵育10 min。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 急性缺氧对环匹阿尼酸诱导的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度升高的影响（图1）

图1 急性缺氧对环匹阿尼酸诱导的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度升高的影响（n = 6）

2.2 氯化镍、SKF96365对急性缺氧作用的干预（图2）

2.3 氯化镍、SKF96365对高钾引起的肺静脉平滑肌细胞内钙浓度的影响（图3）

图2 氯化镍和SKF96365对急性缺氧条件下环匹阿尼酸诱导的肺静脉平滑肌细胞内钙浓度升高的影响（n=6）

图3 氯化镍和SKF96365对高钾引起的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度升高的影响（n=6）

3 讨论

[1] Uzun O, Tuncay DA. Involvement of tyrosine kinase pathway in acute hypoxic vasoconstriction in sheep isolated pulmonary vein. Vascul Pharmacol, 2003, 40: 175-181.

[2] Endo M, Hata M, Saiki Y, et al. Hypoxia and cold stress on pulmonary venous obstruction. Pediatr Cardiol, 2001, 22: 292-296.

[3] Yamamura A, Yamamura H, Guo Q, et al. Dihydropyridine Ca2+channel blockers increase cytosolic [Ca2+] by activating Ca2+-sensing receptors in pulmonary arterial smooth muscle cells. Circ Res, 2013, 112: 640-650.

[4] 承伟, 李智. 钌红、丁卡因对肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌细胞释放功能的影响. 中国循环杂志, 2012, 27: 149-152.

[5] 赵刚, 宋明宝, 于学军, 等. 钙离子跨缝隙连接在内皮细胞与平滑肌细胞间传递的研究. 中国循环杂志, 2013, z（1）: 52.

[6] 彭公永, 周玉民, 蒋永亮, 等. 急性缺氧对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度的影响. 解剖学杂志, 2013, 36: 305-308.

[7] 彭公永, 蒋永亮, 胡国平, 等. 环匹阿尼酸对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度 的影响. 广东医学, 2012, 33: 3511-3514.

[8] Peng G, Wang J, Lu W, et al. Isolation and primary culture of rat distal pulmonaryvenous smooth muscle cells. Hypertens Res, 2010, 33: 308-313.

[9] Wang J, Shimoda LA, Weigand L, et al. Acute hypoxia increases intracellular [Ca2+] in pulmonary arterial smooth muscle by enhancing capacitative Ca2+entry.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2005, 288: L1059-1069.

[10] 彭公永, 周玉民, 胡国平, 等. 原代培养的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的功能研究.中国药理学通报, 2012, 28: 1570-1573.

[11] Peng G, Lu W, Li X, et al. Expression of Store-operated Ca2+ entry and transient receptor potential canonical and vanilloid-related proteins in rat distal pulmonary venous smooth muscle. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2010, 299: L621-630.

Effect of Acute Hypoxia on Cyclopiazonic Acid Induced Intracellular Calcium Cation Enhancement in Rat Distal Pulmonary Venous Smooth Muscle Cells

PENG Gong-yong, HU Guo-ping, ZHAO Zhu-xiang, HU Jin-xing, ZOU Yi-min, PENG Fang.
National Key Laboratory of Respiratory Disease, Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou (510120), Guangdong, China

Acute hypoxia; Cyclopiazonic acid; Pulmonary venous smooth muscle cells; Intracellular calcium cation concentration; Store-operated Ca2+channels

2014-12-01）

（编辑：许 菁）

国家自然科学基金项目（81000020，81570045）；广东省自然科学基金资助项目（2014A030313486）；广州市科技计划资助项目（201510010226）；羊城学者科研计划学术骨干项目（10A025G）；广州市属高校科研项目（10A276）；呼吸疾病国家重点实验室青年科学基金支持项目（11）

510120 广东省广州市，广州医科大学附属第一医院 广州呼吸疾病研究所呼吸疾病国家重点实验室

彭公永 副主任医师 博士 主要从事肺血管疾病基础与临床研究 Email: gongyong19761@163.com 通讯作者：彭公永

R54

A

1000-3614（2015）08-0800-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.08.020