多重RT-PCR方法诊断多种禽呼吸道病原的混合感染

张 磊，莫贞峰

（1.济南市动物疫病预防与控制中心，山东济南 250002；2.济南市畜产品质量安全监测中心,山东济南 250002）

多重RT-PCR方法诊断多种禽呼吸道病原的混合感染

张 磊1，莫贞峰2

（1.济南市动物疫病预防与控制中心，山东济南 250002；2.济南市畜产品质量安全监测中心,山东济南 250002）

在一个RT-PCR反应体系中同时以鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、禽流感病毒（AIV）、鸡新城疫病毒（NDV）、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡毒支原体（MG）和鸡滑液囊支原体（MS）等6种呼吸道病原的RNA或DNA为模板进行扩增RT-PCR。结果显示，6种病原都扩增出了相应大小的特异性产物，表明建立的多重RT-PCR方法可用于混合感染时上述6种病原的鉴别诊断。

禽呼吸道病原；多重PT-PCR；诊断

禽支原体病是近年来临床最常见的呼吸道疾病之一，其中MG是造成经济损失最严重的一种，临床称其为慢性呼吸道病，MS主要引起鸡和火鸡的滑膜炎和亚临床的呼吸道症状，除家禽支原体外，IBV、AIV、NDV、ILTV也是发病较多的家禽呼吸道传染病原，这些病原常常与支原体混合感染发病，引起症状加重，死亡增加[1]。给临床诊断和治疗带来困难。因此，研究快速、敏感、特异的诊断方法是防治呼吸道疾病的关键。用PCR方法单独对以上几种病原进行诊断，已广泛应用于禽病研究领域，但在一个反应中同时对几种主要呼吸道病进行诊断，目前还存在一定的困难。这需要多种反应条件的优化和无数次实验室重复，因此，商品化的诊断试剂盒正在研究中。本文对目前国内最常见6种主要呼吸道传染病病原在同一个RT—PCR反应中检测，取得了理想的结果。

1 材料与方法

1.1 病毒株 IBV（Mass）、AIV（I/W/66）、NDV（Lasota）、ILTV、MG（S6）、MS（W.O）等毒株均由美国SPAFAS公司提供

1.2 鸡胚

10日龄SPF鸡胚，山东省家禽研究所提供。

1.3 试剂

RNA和DNA PCR反应试剂，购自Elmer perlins 公司。

1.4 引物 均由SPAFAS公司合成提供。

病毒 引物 序列 片段大小（bp）IBV 上游 5’-CAT AAC TAA CAT AAG GGC A-3’ 1720下游 5’-TGA AAA CTG AAC AAA AGA CA-3’AIV 上游 5’-AGC AAA AGC AGG GGA TAC-3’ 550下游 5’-GTC TGA AAC CAT ACC ATC C-3’NDV 上游 5’-GGA GGA TGT TGG CAG CAT T-3’ 300下游 5’-GTC AAC ATA TAC ACC TCA TC-3’ILTV 上游 5’-ACG ATG ACT CCG ACT TTC-3’ 647下游 5’-CGT TGG AGG TAG GTG GTA-3’MG 上游 5’-GGATCCCATCT CGACCAGGAGAAAA-3’ 732下游 5’-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’MS 上游 5’-GAAGCAAAAT AGTGATATCA-3’ 207下游 5’-GTCGTCTCGAAGTTAACAA-3’

1.5 支原体培养和病毒增殖

支原体培养液由PPLO肉汤，10%灭活马血清，5%新鲜酵母提取液组成；MS培养液在基础液的基础上加0.02%（NAD）。37℃培养96～120h。

4种病毒的种毒分别作10-2稀释，IBV、AIV、NDV经尿囊腔接种，ILTV经绒毛尿囊膜接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，37℃孵育48～72h，收获尿囊液和绒毛膜，反复冻解3次后置-20℃备用。

1.6 RNA、DNA提取

1.6.1 AIV、NDV、IBV的RNA提取 10mL的病毒尿囊液，2500r/min离心20min，上清移入新的离心管4℃ 20000r/min再离心1h，沉淀用200μL 0.5%DEPC水混悬，加600μL Trizol混匀后至室温5min，再加200μL氯仿，用手轻轻摇匀，室温下静置10min，10000r/min离心15min，上清加入300μL 无水酒精，10000r/min离心10min，沉淀用70%酒精洗涤，工作台下干燥，最后用50μL DEPC溶解沉淀，37℃孵育20min。

1.6.2 ILTV 的DNA提取 绒毛尿囊膜悬液10mL，2500r/min离心20min，上清4℃ 2000r/min离心1h。

1.6.3 MG、MS的DNA提取 5mL支原体培养液4℃ 10000r/min离心20min，沉淀用500μL TE悬浮，4℃，10000r/min，离心20min。PBS 缓冲液（pH 7.2）洗2次。沉淀用500μL TE悬浮后，加50μL 10%SDS（终浓度1%），5μL蛋 白酶K（20μg/ mL）用手轻轻摇匀，37℃，孵育1h。降至室温后，加等体积的 酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）抽提3次；2倍体积的冷无水乙醇和1/10体积的3M醋酸钠，-20℃过夜。14000r/min离心10min。沉淀用70%乙醇洗涤一次。工作台下自然干燥，溶解于40μL TE中。55°C孵育30min，-20℃贮存备用。

1.7 RT-PCR和多重PCR反应条件

联合扩增反应分RT-PCR和PCR两步进行。RT-PCR在40μL体积内进行，每一个反应含有4mM MgCl2，500Mm KCl,150mM Tris-HCl（pH8.0），2mM dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP），2U的RNase抑制物，5U MLV反转录酶，5U Random Hexamers，6种 病 原 的RNA或DNA模 板 各2μL，DECP处理水加至40μL。3滴矿物油覆盖液面，42℃ 15min,99℃ 5min,5℃ 5min一个循环[2]。PCR反应在100μL体积进行，反应中加入4mM MgCl2，500mM KCl,150mM Tris-HCl（pH8.0），6种不同病原的上下引物各1μL，5U Taq DNA聚合酶，DEPC水加至100μL。95℃ 7min使DNA变性；94℃ 1min, 50℃ 1min, 72℃ 2min分别解链、退火、延伸进行35个循环后，72℃再延伸10min，置4℃保存[3]。

1.8 扩增产物检测

水平凝胶电泳用于DNA产物的检测。10μL扩增产物加2μL 载样液，在80V电压，1%的凝胶上进行电泳。凝胶内加入1‰溴乙啶（0.5μg/0.1mL）。电泳液为TBE 缓冲液。紫外线灯下显示扩增结果，并一次成像拍照。

2 结果

在一个RT-PCR反应中同时得到6种呼吸道病原RNA或DNA的扩增产物，图1显示了清晰的电泳条带，IBV为1720bp，AIV为550bp，NDV为300bp，ILTV为647bp，MG为730bp，MS为207bp。用RT-PCR和PCR方法分别对6种不同病原的DNA或RNA扩增的结果与在同一RT-PCR反应中扩增得到的结果一致，表明多重PCR方法的特异性和可行性。

3 讨论与小结

图1 6种呼吸道病原RNA或DNA的扩增产物

家禽呼吸道疾病的混合感染在临床上非常普遍，特别是在饲养环境恶劣的条件下，支原体往往首先爆发继而其它呼吸道病原乘虚而入，造成两种或多种病原的混合感染。应用RT-PCR和PCR技术可及时准确快速地做出诊断，以便正确地采取防治对策，减少不必要的经济损失。多重RT- PCR反应条件复杂，总反应体积较大，样品DNA的浓度、引物的筛选和浓度对反应至关重要，但在反复试验中最大的体会是DNA聚合酶的使用，DNA聚合酶的质量和最终浓度是决定试验成败的关键因素。用与单独RT- PCR同样的条件来处理复合RT- PCR反应很难得到理想的结果。文中所列RT-PCR的反应条件经过多次反复实验得出的最佳反应条件，其过程不一一赘述。

试验结果证明，多重RT- PCR诊断支原体与其他RNA或DNA病毒的混合感染时是特异的，并可节省时间和费用，值得推广应用，由于时间所限，我们仅对实验室的细菌和病毒培养物进行了实验，取得了满意的结果，为下一步的临床检测奠定了基础。

[1] 朱连德. 鸡慢性呼吸道病的综合控制措施[J].中国家禽，1999，21（12）：36-37.

[2] 邓显文，谢芝勋，等. PCR和多重PCR技术对人工感染鸡毒支原体SPF鸡样品的检测[J].广西农业科学，2005，36（1）：48-50.

[3] Wang X，Khan M I. A multiplex PCR for Massachusetts and Arkansas serotypes of infectious bronchitis virus[J]. Molecular and Cellular Probes，1999，13（1）：1-7.

（责任编辑：胡藕祥）

Application of Multiplex RT-PCR Assay for Detection of Mixed Infection with 6 Avian Respiratory Pathogens

Zhang Lei1Mo Zhenfeng2
（Jinan Animal Disease Prevention and Control Center，Jinan，Shandong 250002；2.Jinan Animal Product Quality and Safety Surveillance Center，Jinan，Shandong 250002）

With DNAs or RNAs of 6 avian respiratory pathogens i.e. infectious bronchitis virus（IBV），avian influenza virus（AIV），Newcastle disease virus（NDV），infectious laryngotracheitis virus（ILTV），Mycoplasma gallisepticum（MG）and Mycoplasma synoviae（MS）as template, amplification was conducted in one multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction（RT-PCR）system. The result showed that one unique segment was obtained for each of the above 6 pathogens respectively. It was concluded that this established multiplex RT-PCR system could be used for differentiation of complicated infections with MG，MS，AIV，NDV，IBV and ILTV.

avian respiratory pathogen；multiplex RT-PCR；control

S852.65+7

B

1005-944X（2015）08-0076-03