同型半胱氨酸对内皮细胞肌球蛋白轻链激酶表达的影响

吴 燕，王 怡，江巧玲，周佳丽，周 青，汪 渊，朱华庆

同型半胱氨酸对内皮细胞肌球蛋白轻链激酶表达的影响

吴 燕，王 怡，江巧玲，周佳丽，周 青，汪 渊，朱华庆

目的研究同型半胱氨酸（Hcy）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）运动能力以及肌球蛋白轻链激酶（MLCK）表达的影响。方法不同浓度的Hcy处理人脐静脉内皮细胞后，MTT法检测Hcy对HUVEC增殖的影响，划痕实验检测Hcy对细胞迁移的影响，免疫组化法及Western blot法检测MLCK表达的变化。结果随着浓度的升高，Hcy对HUVEC的增殖有显著的抑制作用，对HUVEC的迁移有明显的促进作用，免疫组化法及Western blot法结果显示Hcy可以增强MLCK的表达。结论Hcy对HUVEC的迁移具有促进作用，可能是Hcy通过上调MLCK的表达所致。

同型半胱氨酸；动脉粥样硬化；人脐静脉内皮细胞；肌球蛋白轻链激酶

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是大多数心脑血管疾病的重要病理基础，给人类健康带来极大的威胁，而其发病机制非常复杂，其中内皮细胞损伤被认为是动脉粥样硬化的始动环节［1－2］。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一种含巯基氨基酸，是人体内甲硫氨酸代谢过程的中间产物，近年来，大量研究［3］证明同型半胱氨酸可以损伤内皮细胞，是致AS的一个独立危险因素。肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）是一种钙调素依赖酶，能催化肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）磷酸化，引起内皮细胞收缩，细胞骨架重排，从而调节内皮细胞的通透性［4］。该研究通过采用同型半胱氨酸处理人脐静脉内皮细胞（human umbilicalvein endothelial cells，HUVEC），初步探讨了Hcy对HUVEC增殖、迁移能力的影响以及在此过程中MLCK表达的变化，为Hcy致AS的发生和发展机制提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料HUVEC购于美国ATCC公司；胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖培养基购于美国Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、Hcy购于美国Sigma公司，MTT用PBS配制成5%母液，Hcy用纯化水配制成200 mmol／L母液，分别过滤除菌，－20℃避光保存。BCA定量试剂盒、ECL显色试剂盒均购于美国Pierce公司；免疫组化染色试剂盒、DAB试剂盒购于北京中杉金桥公司；鼠抗人β-actin、MLCK均购于美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人脐静脉内皮细胞，培养于含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 μg／ml链霉素的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱。当细胞处于对数生长期时，用0.25%（含0.53 mmol／L EDTA）的胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 MTT法 取对数生长期的HUVEC，接种于96孔板中（3 000～4 000个／孔），边缘孔用200 μl PBS填充。细胞贴壁后，吸去原培养液，每孔加入200 μl含不同浓度的Hcy（0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mmol／L）培养液，每组4个复孔，设立细胞对照组，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。吸去原液，每孔加入200 μl新鲜DMEM培养液及20 μl MTT，37℃继续培养4 h。小心弃去上清液，每孔加入100 μl DMSO，震荡10 min溶解结晶后于570 nm测吸光度（optical density，OD）。抑制率（%）＝（对照孔OD570－试验孔OD570）／对照孔OD570×100%。

1.2.3 细胞划痕实验 HUVEC用胰蛋白酶消化后吹打成单细胞悬液，将细胞悬液均匀接种于12孔板中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。待细胞长满后用灭菌白枪头在12孔板底部画出井字形，PBS洗3次，洗去划下的漂浮细胞，加入培养液后在交叉线处拍照。拍照后换入含有不同浓度Hcy（0.1、0.5、1.0 mmol／L）的培养液，每12 h拍照一次，拍照前后均要换液。Quantity One软件测量每组细胞划痕边界的距离，细胞相对迁移率（%）＝（药物处理前的距离－药物处理后的距离）／药物处理前的距离。

1.2.4 免疫组化实验 取处于对数生长期的HUVEC，胰酶消化后接种于含有灭菌圆形盖玻片的6孔板中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养过夜。次日细胞贴壁后分别加入含不同浓度Hcy（0.1、0.5、1.0 mmol／L）的培养液，并设立细胞对照组及阴性对照组（PBS代替一抗孵育）培养48 h。取出6孔板，多聚甲醛固定细胞1 h，PBS洗3遍，将盖玻片取出置于载玻片上，吸干盖玻片周围PBS，山羊血清封闭10 min，加一抗4℃过夜。二抗孵育15 min，PBS洗3遍，加入链霉卵白素孵育15 min，PBS洗后DAB显色。自来水冲洗后苏木精复染，自来水返蓝，分别经95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。

1.2.5 Western blot 将细胞均匀接种于细胞培养瓶中，待细胞贴壁生长后用不同浓度Hcy（0.1、0.5、1.0 mmol／L）处理48 h。冰PBS洗涤细胞后，加入蛋白提取液（Tris-HCl，pH 7.14；150 mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，1%Triton，0.1%SDS，5 mg／ml Leupeptin，1 mmol／L PMSF），冰上裂解30 min，用细胞刮轻轻将细胞刮下置－80℃及4℃冰箱反复冻融2～3次。14 000 r／min、4℃离心30 min后吸取上清液进行BCA定量，将所有样本调整为相同浓度并加入4×蛋白上样缓冲液后煮沸，－80℃保存备用。配制10%的凝胶，加样后恒压进行SDSPAGE电泳，电泳结束后恒流将蛋白转移至PVDF膜上，3%～5%的脱脂牛奶室温封闭2 h，PBS洗3次后置于一抗［MLCK（1∶500）或β-actin（1∶1 000）］中孵育过夜。加入HRP标记的二抗室温孵育2 h，PBS洗3遍，在暗室中将等比例混合后的ECL试剂A液和B液均匀涂于膜上，覆盖X线片曝光，显影，定影。片子扫描后，用Quantity One软件对其进行灰度值分析。

1.3 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行分析，数据用±s表示。组间计量资料采用成组设计的方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 Hcy对HUVEC增殖的影响 MTT结果显示Hcy能明显抑制HUVEC在体外的增殖，并且抑制效果随Hcy浓度的升高而增强，提示Hcy抑制HUVEC的增殖呈明显的剂量依赖性（F＝13.866），见表1。

表1 不同浓度Hcy对HUVEC增殖的影响（n＝4，±s）

与细胞对照组比较：*P＜0.05

组别OD570值抑制率（%）细胞对照1.07±0.08－Hcy（mmol／L）0.11.00±0.0812.85*0.40.92±0.1029.27*0.60.83±0.0346.59*0.80.81±0.0846.70*1.00.77±0.0558.00*2.00.75±0.0262.07*

2.2 Hcy对HUVEC迁移的影响 HUVEC在加药处理24 h和36 h后，Hcy组划痕处的细胞明显比细胞对照组多，且随着药物浓度的升高划痕间隙越来越小，说明Hcy可以明显促进HUVEC的迁移，且随着药物浓度的升高迁移效果越明显（F＝56.61），见图1。

2.3 细胞免疫组织化学法检测MLCK的表达免疫组织化学结果显示细胞对照组仅有极少量细胞着色且着色很浅；0.1 mmol／L Hcy处理细胞后棕黄色的MLCK表达量增强；0.5 mmol／L Hcy处理后可见细胞胞质大量着色，且着色更深；1.0 mmol／L Hcy组染色细胞阳性表达最强，胞质呈深棕黄色，见图2。

2.4 Western blot检测MLCK的表达不同浓度的Hcy作用于HUVEC 48 h后，结果显示与细胞对照组相比Hcy处理后的细胞MLCK表达显著增强，且随着Hcy浓度的升高，细胞中MLCK的表达量逐渐加强（F＝62.276），见图3。

3 讨论

在人体内，Hcy主要是甲硫氨酸脱甲基后的产物。Hcy有两种代谢途径，一方面可以通过转硫作用生成半胱氨酸和α-酮丁酸，另一方面可以发生甲基化，重新形成甲硫氨酸，以保持体内Hcy的平衡。与Hcy体内合成和代谢相关的酶、叶酸、维生素B12等的缺乏都可能引起高同型半胱氨酸血症［5］。AS是由多种因素共同参与的一种疾病，包括高血压、高血脂、糖尿病、吸烟等，而高同型半胱氨酸血症是导致AS的一个重要因素，目前其机制尚未完全明确。

血管内皮细胞是附着于血管壁的单层表皮细胞，是血液和组织液之间的转运屏障，能合成和分泌多种活性物质，保证血管正常的收缩和舒张，使循环血液保持流动状态，防止血栓形成。AS与内皮细胞之间具有密切的联系，AS的产生始于内皮细胞的损伤。有研究［6－7］表明Hcy可以通过巯基发生自身氧化，产生的过氧化氢、超阴离子和羟自由基等活性氧诱导氧化应激反应，导致内皮细胞的直接损伤，同时，释放的大量炎症因子会破坏血管内皮，引起内皮功能紊乱，进一步加剧AS的发展。该研究采用体外培养HUVEC，经不同浓度Hcy处理后，MTT结果显示与细胞对照组相比较，Hcy组细胞的增殖受到明显抑制，且抑制效果呈浓度依赖性。

近年来研究［8］显示MLCK在调节内皮细胞收缩以及血管内皮屏障功能中发挥着重大作用，是MLC磷酸化的重要调节蛋白。MLC磷酸化水平与骨架收缩活动直接相关，MLCK表达增加可以上调MLC磷酸化水平，导致内皮细胞收缩加剧，通透性增加，细胞形态和功能完整性遭到破坏，脂质更容易发生浸润［9］。该研究Western blot以及免疫组化结果显示，与细胞对照组相比，Hcy处理组细胞中MLCK的表达量显著上升，且随着药物浓度的升高而增加，提示Hcy可以上调MLCK的表达。MLC的磷酸化水平与细胞迁移也是密切相关的，MLCK诱导细胞周边和前端MLC磷酸化，磷酸化的MLC加强肌球蛋白和肌动蛋白微丝的相互作用，增强细胞的运动能力，从而促进细胞的迁移［10］。划痕实验显示Hcy处理HUVEC 24 h及36 h后，在显微镜下可以观察到划痕距离的缩短，且随着药物浓度的升高，划痕距离的缩短更加显著，从而提示Hcy可以促进HUVEC的迁移。

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The effect of homocysteine on the expression of MLCK in human umbilicalvein endothelial cells

Wu Yan，Wang Yi，Jiang Qiaoling，et al
（Dept of Biochemistry and Laboratory of Molecular Biology，Anhui Medical University，Dept of Key Laboratory，Gene Resource Utilization for Severe Disease of Anhui Province，Hefei 230032）

ObjectiveTo explore the effect of homocysteine（Hcy）on movement ability and expression of myosin light chain kinase（MLCK）in human umbilicalvein endothelial cells（HUVEC）.MethodsMTT assay was detected to measure the proliferation of HUVEC treated with different concentrations of homocysteine.The effect of Hcy on migration of HUVEC was measured by wound healing assay.The expression of MLCK was analyzed by immunohistochemistry and Western blot.ResultsWith the increase of concentration，Hcy could inhibit the proliferation of HUVEC and promote the migration of HUVEC remarkably.Immunohistochemistry and Western blot showed that Hcy could enhance the expression of MLCK significantly.ConclusionHcy can promote the migration of HUVEC，which may relate to the up-regulation of expression of MLCK

Hcy；atherosclerosis；HUVEC；MLCK

R 966；R 541.4；R 34

1000－1492（2015）01－0012－04

2014－09－11接收

国家自然科学基金（编号：81070232、81270372）

安徽医科大学分子生物学实验室、生物化学与分子生物学

教研室、安徽省／省部共建教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室，合肥 230032

吴 燕，女，硕士研究生；

朱华庆，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：aydzhq＠126.com