鞘碱性蛋白活化的SD大鼠T细胞培养与鉴定

赵 皓，余 晾，张敬星，陈月娟，吕合作，，王保龙

鞘碱性蛋白活化的SD大鼠T细胞培养与鉴定

赵 皓1，2，余 晾2，张敬星3，陈月娟3，吕合作2，3，王保龙1

目的培养针对髓鞘碱性蛋白（MBP）特异的SD大鼠T淋巴细胞，对其表型和细胞因子分泌特征进行鉴定。方法将MBP免疫SD大鼠，收集回流淋巴结，制备成单细胞悬液，在RMPI 1640培养液中用MBP反复刺激获得MBP特异性T细胞（MBP-T）。然后用3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法测定其对MBP刺激的反应性，用流式细胞术鉴定其表型和细胞因子的产生。结果当MBP抗原存在的情况下，MBP-T的3H-TdR掺入量明显增加。流式细胞术检测表明MBP-T主要为CD3＋CD4＋的T淋巴细胞（98%），并可以产生干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素10（IL-10）等细胞因子。结论MBP免疫SD大鼠的回流淋巴结细胞，经过体外扩增可以获得MBP特异性的T细胞，其表型主要为CD3＋CD4＋，并可以产生Th1和Tr1型细胞因子。

髓鞘碱性蛋白；淋巴细胞；免疫；流式细胞术

传统观点认为中枢神经系统（central nervous system，CNS）是一个免疫豁免区，CNS抗原如髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）与免疫系统在解剖学上处于隔离状态，被称为隐蔽抗原［1－2］。因而，长期以来一直认为CNS损伤后的自身免疫反应会加重继发性损害，不利于神经保护和神经再生［3－4］。然而，以色列Schwartz et al［5］研究小组却提出CNS“保护性自身免疫”学说。该学说认为CNS损伤后的自身免疫反应除具有加重继发性损伤的负面作用外，也具有神经保护和促进神经再生的积极作用，只是在自然状态下，这种作用过于微弱，被其负面作用压制而难以表现。采用一些免疫干预的手段，如用体外扩增的MBP特异性T细胞（myelin basic protein specific T cells，MBP-T）进行过继免疫则可以激发这种神经保护作用［6］。因此，该研究拟采用MBP免疫SD大鼠，获取回流淋巴结，再通过反复刺激的方法体外扩增MBP特异的T细胞，然后采用流式细胞术检测其表型和细胞因子分泌特征。

1 材料与方法

1.1 实验动物5只健康成年清洁级SD大鼠，220～250 g，由蚌埠医学院实验动物中心提供。动物实验和护理均按照美国国家研究委员会1996年制定的《实验动物护理和使用指南》及蚌埠医学院动物保护和使用委员会制定的《啮齿动物生存手术的方针政策》执行。

1.2 主要试剂与仪器完全福氏佐剂（complete freund’s adjuvant，CFA）（美国BBI公司）；MBP、刀豆蛋白A（concanavalin A，conA）、丝裂霉素C、多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）、Monesion（美国Sigma公司）；RMPI 1640（美国Gibco公司）；谷氨酰胺、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二巯基乙醇、丙酮酸钠（中国华美公司）；庆大霉素（上海中西制药有限公司）；Ficoll淋巴细胞分离液（上海试剂二厂）；复方泛影葡胺（上海淮海制药厂）；重组人IL-2（recombinant human interleukin-2，rhIL-2）（长春长生基因药业公司）；100×Glutamine、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、汉克斯平衡盐溶液（hank′s balanced salt solution，HBSS）（Ca2＋，Mg2＋free）（美国Invitrogen公司）；3H-胸腺嘧啶（3H-thymidine，3H-TdR）（北京原子能股份有限公司）；戊巴比妥钠（上海化学试剂采供站进口分装）；FITC标记的CD3单克隆抗体（FITC conjugated anti-CD3 mAb，CD3-FITC）、PE标记的CD4单克隆抗体（PE conjugated anti-CD4 mAb，CD4-PE）、APC标记的CD8单克隆抗体（APC conjugated anti-CD8 mAb，CD8-APC）（美国Caltag laboratories）；FITC标记的IFN-γ抗体（FITC conjugated anti-IFN-γ，IFN-γ-FITC）（美国Harlan公司）；PE标记的IL-10抗体（PE conjugated anti-IL-10，IL-10-PE）、FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；eFluor®660标记的IL-4抗体（eFluor®660 conjugated anti-IL-4，IL-4-eFluor®660）（美国eBioscience公司）。

1.3 MBP-T的培养与扩增将MBP溶于磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）配成1 mg／ml的浓度，与等量的CFA（4 mg／ml热灭活的结核杆菌）混合，置2只注射器中来回抽推制成MBP／CFA油包水乳剂，4℃保存备用。将0.2 ml MBP／CFA乳剂注射于SD大鼠双侧后足跖真皮内进行免疫。免疫9 d后，无菌取大鼠腹股沟淋巴结，制备成单细胞悬液，用RMPI 1640洗2次后，用刺激培养基（RMPI 1640添加L-谷氨酰胺2 mmol／L、二巯基乙醇50 μmol／L、丙酮酸钠1 mmol／L、Hepes 10 mmol／L、庆大霉素50 000 IU和体积分数为2%的同基因SD大鼠血清）调细胞浓度至1×107／ml，加MBP（25 mg／L）于37℃5%CO2培养箱中培养3 d，刺激MBP特异的T细胞，使之活化。培养3 d后，收集细胞，室温离心（1 000 r／min，10 min）取沉淀，用2 ml RMPI 1640液重悬细胞。用3 ml Ficoll淋巴细胞分离液（用泛影葡胺调密度至1.088）于1 500 r／min离心30 min后分离活化的T细胞母细胞。用增殖培养基（RMPI 1640添加2 mmol／L L-谷氨酰胺、50 μmol／L二巯基乙醇、1 mmol／L丙酮酸钠、10 mmol／L Hepes、50 000 IU庆大霉素、2%的同基因SD大鼠血清、8%FBS和50 U／ml rhIL-2）调细胞密度至1× 106／ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。5～7 d后，用增殖培养基调T细胞浓度至1×106／ml，与1 ×107／ml同基因SD大鼠丝裂霉素C（50 μg／ml，37℃孵育30 min）处理的脾细胞悬液（作为抗原递呈细胞）及MBP（25 mg／L）在37℃、5%CO2培养箱中共同培养。2～3 d后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离活化的T细胞，再以增殖培养基培养扩增5～7 d。在T细胞生长培养基中，当T细胞开始变小，并不再增殖时，则用MBP再次刺激T细胞活化、培养扩增。如此反复，经过3个活化、扩增循环后，便可得到足够数量的MBP-T细胞。

1.4 淋巴细胞增殖分析将MBP-T细胞用不含rhIL-2的增殖培养基调整为2×106／ml浓度，按实验设计分组，每组设3个复孔，分别取100 μl加入到96孔培养板中，细胞密度为2×105个细胞／孔，同时在每孔中均加入2×106个丝裂霉素C处理的脾细胞作为抗原递呈细胞。然后在每孔中加入25 μg／ml MBP（MBP刺激组）或25 μg／ml BSA（BSA对照组），以及只加培养基（阴性对照组）。最后，各组添加不含rhIL-2增殖培养基至终体积为200 μl，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育48 h，加入3.7× 10－5GBq／well的3H-TdR，再进一步培养18 h，用多头收集仪将细胞收集到玻璃纤维膜上，并用β液体闪烁计数仪测定细胞掺入的放射性强度。

1.5 流式细胞术细胞表面标志染色：将待测细胞用冰冷PBS洗涤后，用染色缓冲液（含5%FBS、0.1%NaN3的PBS）配制成2×106／ml的细胞悬液。在离心管中预先加入荧光素标记抗体：CD3-FITC（1 μg／106细胞）、CD4-PE（0.25 μg／106细胞）和CD8-APC（0.2 μg／106细胞）；同时设立不加抗体的空白对照管。每管加细胞悬液50 μl置室温20 min，然后用PBS离心洗涤2次，最后加含1%PFA的PBS 0.4 ml固定。胞内细胞因子染色：将1×106MBP-T细胞培养于不含rhIL-2的增殖培养基中，分别添加25 μg／ml MBP（MBP刺激组）、25 μg／ml BSA（BSA对照组），同时设立只加培养基的阴性对照组。于37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h，加入monesion至终浓度2 μmol／L，用于阻滞细胞因子蛋白分泌，继续培养4 h后收集细胞用于检测。用PBS洗涤细胞后，加2%PFA 400 μl，4℃避光30 min以上以固定细胞。然后，用染色缓冲液（1 ml／管）4℃1 000 r／min离心5 min洗细胞1次，加400 μl透膜缓冲液（含0.1%Saponin-5%FBS的PBS）4℃避光透膜15 min，离心弃上清液，同时加入细胞因子抗体：IFN-γ-FITC（1 μg／106细胞）、IL-10-PE（1 μg／106细胞）和IL-4-eFluor®660（1 μg／106细胞），4℃避免孵育30 min。每管加透膜缓冲液1 ml，4℃、1 000 r／min离心5 min，洗2次，加1%PFA 400 μl固定。用FACS Calibur流式细胞仪Cellquest软件检测待检样品，所得数据文件用Cellquest或WinMDI 2.9软件分析。

1.6 统计学处理两组数据之间的比较采用t检验，3组数据之间的比较采用方差分析和q检验，数据以±s表示，应用Excel进行统计分析。

2 结果

2.1 MBP-T细胞的表型特征 MBP免疫9 d后，在新鲜分离的淋巴结细胞（lymph node cells，LNC）中，CD3＋细胞占细胞总数的百分比为（59.98± 7.16）%，在CD3＋细胞中CD3＋CD4＋的细胞为（74.78±8.77）%，CD3＋CD8＋的细胞为（20.21± 2.78）%。经过体外3个循环的刺激、扩增后，MBP活化扩增的细胞主要为CD3＋的T淋巴细胞（98.62 ±0.71）%，在CD3＋细胞中CD3＋CD4＋的细胞占绝大多数，为（97.29±1.44）%，而CD3＋CD8＋的细胞则非常少，其比例仅为（1.70±1.23）%。MBP活化扩增的细胞与新鲜分离的LNC比较，其CD3＋细胞占细胞总数的比例和CD3＋细胞中CD4＋细胞的比例均明显升高，而其CD8＋细胞的比例则明显降低，各指标比较差异有统计学意义（P＜0.01，t＝12.01、5.66、13.62）。见图1。

2.2 MBP抗原特异性淋巴细胞增殖分析在阴性对照组和BSA对照组，所有的细胞均没有明显的增殖反应，其3H-TdR掺入量分别为（655.40±171.86）cpm和（677.20±220.97）cpm，两者之间差异无统计学意义。当存在25 μg／ml MBP的情况下，MBP-T细胞的3H-TdR掺入量明显增高，达（14 094.80± 3 300.75）cpm，与阴性对照组和BSA对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01，F＝82.16）。

2.3 MBP-T细胞分泌细胞因子的特征流式细胞术胞内细胞因子检测表明：在阴性对照组和BSA对照组，MBP-T细胞中均几乎检测不到IFN-γ、IL-10和IL-4的表达。在阴性对照组中，三者表达的阳性细胞仅分别为（1.13±0.63）%、（0.76±0.24）%和（0.59±0.16）%；在BSA对照组中，三者表达的阳性细胞也仅分别为（1.30±0.55）%、（0.95± 0.47）%和（0.64±0.19）%。3种因子的表达率在两组之间差异均无统计学意义。用MBP刺激后，IFN-γ和IL-10表达的阳性细胞则明显增加，分别为（28.08±6.85）%和（14.67±5.52）%，与阴性对照组和BSA对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。但是，仍几乎检测不到IL-4的表达，其比例仅为（0.69±0.36）%，与阴性对照组和BSA对照组比较差异无统计学意义（F＝75.86、31.02、0.159）。见图2。

3 讨论

CNS损伤后，由于损伤部位组织细胞的坏死和凋亡，CNS抗原能够释放出来，激活免疫系统产生一系列免疫反应，包括损伤局部小胶质细胞的活化，外周单核巨噬细胞、淋巴细胞等的浸润。随后，CNS抗原可以被活化的小胶质细胞或单核巨噬细胞加工递呈给相应的T淋巴细胞，使之活化，从而产生针对自身CNS抗原反应的T细胞群体［7］。虽然目前对自身反应性T细胞对在CNS损害后的作用仍存在争议，但是其参与CNS损伤与修复的过程是毋容置疑的［8］。在这些CNS自身反应性T细胞中，MBP活化的T细胞倍受研究者关注，因此对于该细胞在CNS损伤修复中的争议也很多［9－11］。

在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究［12］中，通过MBP免疫EAE敏感的动物（如Lewis大鼠）是建立EAE模型的经典方法。采用MBP主动免疫这些动物品系能够诱导典型的EAE表现，也可以通过体外扩增的方法获得MBP特异的T细胞。但是，这些细胞在随后的过继免疫治疗研究［10］中常常会出现中枢神经损害性的结果。为了尽量减少过继免疫诱发的EAE症状对评价自身免疫保护效应的干扰，本研究在前期的实验中采用SD大鼠［9］。与EAE-敏感的Lewis rat大鼠不同，SD大鼠是EAE-抵抗种系，结果表明MBP-T细胞过继免疫同种系的SD大鼠可以激发中枢神经保护作用［9］。本研究采用流式细胞术鉴定这类细胞的表型和细胞因子分泌特征，以期为目前存在的争议提供可能的解释。

研究显示，在新鲜分离的LNC中，CD3＋细胞占细胞总数约60%，其中CD3＋CD4＋的细胞约为75%，而CD3＋CD8＋的细胞约为20%。经过体外3个循环的刺激、扩增后，MBP活化扩增的细胞主要为CD3＋的T淋巴细胞，且CD3＋CD4＋的细胞占绝大多数（98%），与文献［9，13］报道一致。3H-TdR掺入实验表明这种细胞是MBP特异性的。根据分泌细胞因子种类的不同，分化的CD4＋Th细胞可分为Th1、Th2、Th3和Tr1等细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2和IFN-γ，主要介导细胞免疫应答；Th2主要分泌IL-4和IL-5，主要介导体液免疫；Tr1／Th3主要分泌IL-10／TGF-β，对免疫系统的功能具有抑制性调节作用［14－15］。本研究显示MBP-T细胞表达IFN-γ和IL-10，却没有检测到IL-4，这说明在MBP-T细胞中除了Th1细胞存在外，还有一定比例的具有免疫抑制调节作用的Tr1细胞亚型，这类细胞在CNS免疫反应过程中可能具有特有的调节功能（如调节损伤局部巨噬细胞或小胶质细胞的活化），从而影响CNS损伤的最终结局。

综上所述，用MBP免疫SD大鼠，经过体外扩增可以获得MBP特异性的T细胞，其表型主要为CD3＋CD4＋，并可以按照细胞因子的产生区分为Th1和Tr1亚型。

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Culture and identification of myelin basic protein activated T cells in SD rats

Zhao Hao1，2，Yu Liang2，Zhang Jingxing3，et al

（1Dept of Medical Laboratory，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；
2Central Laboratory，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004；
3Anhui Provincial Key Laboratory of Tissue Transplantation，Bengbu 233030）

ObjectiveTo culture the myelin basic protein（MBP）specific T lymphocytes in SD rats，and identify their characterization of phenotype and cytokine profiles.MethodsThe SD rats were immunized with MBP；the draining lymph nodes were collected and made into single cell suspension.The cells were cultured in RMPI 1640 medium and stimulated repeatedly with MBP to produce MBP specific T（MBP-T）cells.Then，their reactivity to MBP stimulation was measured using3H-thymidine（3H-TdR）incorporation，the phenotype and cytokine profiles were determined using flow cytometry.ResultsWhen the MBP antigen exists，3H-TdR incorporation of MBP-T cells increased obviously.Flow cytometry showed that MBP-T cells were mainly CD3＋CD4＋T lymphocytes（98%），and could produce interferon-γ（IFN-γ）and interleukin-10（IL-10）.Conclusion The cells collected from the draining lymph nodes of MBP immunized SD rats could be amplified into MBP-T cells in vitro.The phenotypes of these cells are mainly CD3＋CD4＋，and show the Th1 and Tr1 cytokine profiles.

myelin basic protein；lymphocytes；immunity；flow cytometry

R 392.12

A

1000－1492（2015）

2014－09－23接收

国家自然科学基金（编号：81071268、81271363）

1安徽医科大学附属省立医院检验科，合肥 230001

2蚌埠医学院第一附属医院中心实验室，蚌埠 2330043组织移植安徽省重点实验室，蚌埠 233030

赵 皓，男，主管检验师，硕士研究生；

王保龙，男，教授，主任检验师，博士生导师，责任作者，E-mail：wbl196555＠163.com