p22-phox在P19细胞向心肌细胞分化前后的变化

吴继军，韩卫星，刘 超，陈晓蓉，王 成，卢挪挪

p22-phox在P19细胞向心肌细胞分化前后的变化

吴继军1，韩卫星1，刘 超2，陈晓蓉2，王 成3，卢挪挪

目的探讨P19细胞向心肌细胞分化前后p22-phox水平的变化。方法贴壁培养P19细胞，取合适细胞株，应用0.9%二甲基亚砜（DMSO）诱导培养，收集诱导不同时间的细胞，通过Western blot检测其肌钙蛋白I（cTnI）水平，以确定分化，并行Western blot检测P19细胞向心肌细胞分化前后细胞中p22-phox蛋白水平。结果①P19细胞经0.9%DMSO诱导分化后，于第8天开始检测到cTnI表达阳性，后cTnI表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。②P19细胞向心肌细胞分化后细胞内p22-phox水平较分化前高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 p22-phox在P19细胞向心肌细胞分化后表达增加，氧化应激水平增高。

P19细胞；心肌细胞；细胞分化；氧化应激；p22-phox

氧化应激是指体内生成的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）水平和抗氧化系统水平失衡，ROS生产过多或（和）机体抗氧化能力减低，致使ROS清除不足，在体内聚积，导致组织器官的氧化性损伤［1－3］。它是导致心血管疾病常见的一个中间者，然而其引起心血管危险的发生又不同于其他常见的危险因素，成为众多危险因素引起心血管疾病的一个共同途径，对于氧化应激标志物的研究已成为目前研究的焦点［4］。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是由1个三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）酶结合蛋白Rac、2个膜亚基p22-phox、gp91-phox以及3个胞质亚基p40-phox、p47-phox、p67-phox组成的复合体，是机体内生成ROS的主要酶之一［5－6］。因此，细胞内p22-phox的水平在一定程度上反映细胞内氧化应激水平。该研究通过检测p22-phox水平来反映P19细胞向心肌样细胞分化前后氧化应激水平的变化。

1 材料与方法

1.1 材料 P19细胞株由安徽医科大学组胚学教研室组织工程干细胞研究所提供，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、α-MEM培养基购自美国Hy-Clone公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胰蛋白酶购自美国Sigma公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，蛋白提取试剂盒购自凯基公司，肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）单克隆抗体购自美国Chemicon公司，p22-phox单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 P19细胞复苏、培养和传代 将水浴箱预热至约37℃，从液氮中取出冻存的P19细胞，快速放入水浴箱中，不停摇晃，使其迅速融化。待冻存管内冰晶完全融解后立即转入5 ml离心管，加α-MEM完全培养液3 ml（含90%α-MEM、10%FBS、青霉素100 U／ml、链霉素100 U／ml），1 000 r／min离心5 min，吸去上清液，再次加入完全培养液2 ml，轻轻吹打、重悬细胞，待细胞悬液分布均匀后取适当细胞悬液转入组织培养皿，于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞长满培养皿底面约75%，弃去上清液，以无菌PBS洗2次，加胰酶1 ml，放入培养箱消化约5 min后取出，加入等量完全培养液吹匀，以一定密度传代。

1.2.2 P19细胞向心肌细胞诱导 将胰酶消化后的P19细胞以1×106个／ml的密度接种到10 cm细菌培养皿，加入诱导培养液10 ml（含0.9%DMSO的完全培养液），悬浮培养。第3天用7 ml诱导培养液不完全换液。待第4天形成大量细胞聚集体，吸取适量该细胞聚集体转入6 cm组织培养皿进行贴壁培养，后每2 d以完全培养液换液1次。

1.2.3 Western blot测定细胞中p22-phox及cTnI水平 蛋白提取试剂盒提取蛋白后以BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，100℃水浴5 min，置于冰上代用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，12%浓缩胶以120 V电压电泳，5%分离胶以150 V电压电泳。后取出凝胶，以40 mA恒流低温转膜过

夜。取出PVDF膜，TBST洗膜3次，每次10 min，1%脱脂奶粉溶液封闭1 h，后分别加以p22-phox及cTnI一抗于4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗孵育2 h，再以TBST洗膜3次，每次10 min，压片曝光。

1.3 统计学处理应用SPSS 11.0统计软件进行分析，cTnI蛋白水平及分化前后细胞内p22-phox蛋白水平的比较采用配对设计定量资料的t检验，Western blot结果目的条带应用软件Image J进行灰度值计算，检验水准取P＝0.05。

2 结果

2.1 细胞形态观察胰酶消化完接种好的未诱导分化的P19细胞大略呈圆形，胞体较小，分散均匀，约2 h可见细胞开始贴壁，呈扁平的不规则多边形；第4天可见有大量胚胎样小体形成，悬浮生长，形态各异，大小不一，多数呈圆形，小体表面有囊状突起；第8天可见细胞贴壁生长，分布密集，多数呈梭状。见图1。

2.2 P19细胞向心肌细胞诱导分化过程中cTnI检测P19细胞经过含0.9%DMSO的培养液诱导，cTnI于第8天呈现阳性，第10天水平高于第8天，差异有统计学意义（t＝31.758，P＝0.000）；第12天水平高于第10天，差异有统计学意义（t＝12.394，P＝0.000）。见图2。

2.3 P19细胞分化前后p22-phox水平的变化诱导分化第10天细胞内的p22-phox水平明显高于正常未分化的P19细胞，差异有统计学意义（t＝3.261，P＝0.017）。见图3。

3 讨论

氧化反应调节着正常机体内的多种生理反应，对于机体的平衡起着重要作用，调节的失衡可导致一系列不良影响。随着机体各组织器官的发育、衰老，其氧化应激水平也在不断变化。氧化应激损伤的严重性主要取决于分子靶标、氧化应激水平的高低以及氧化应激的具体产生机制，其与心血管疾病、神经退行性疾病以及癌症等诸多疾病的发生有着密切联系［7］。心血管各种疾病与氧化应激水平的关系尤为密切，如高血压病、动脉粥样硬化等心血管常见病［8－9］。氧化应激的作用表现主要在于影响细胞的生长、增殖、迁移以及激活等方面，在机体某些病理条件下，ROS与组织炎症、细胞增殖激活障碍和内皮功能紊乱等方面有着密切联系。

P19细胞是目前试验中用来研究干细胞向心肌细胞分化较为常用的细胞之一，本研究表明其向心肌细胞分化后p22-phox蛋白表达增加，表明心肌细胞在其分化过程中氧化应激水平升高。氧化应激在干细胞生长分化的过程中发挥着重要作用，细胞内的低水平ROS对于保持其未分化状态以及维持自我更新极为重要，而高水平ROS的生成将会导致干细胞的分化、衰老乃至凋亡［10］。本研究结果也证实了细胞内氧化应激水平的增高是P19细胞产生分化的一个重要因素。氧化应激水平升高使干细胞产生分化，但同时高水平氧化应激也导致其分化后降低或丧失了自我更新修复能力，引起细胞、组织的衰老和凋亡。心肌细胞内高水平的氧化应激与心肌组织的多种疾病如心衰、心肌梗死等有着重要联系［11－12］。在心肌疾病治疗的一些传统药物中，如β受体阻滞剂、AT1受体拮抗药以及血管紧张素转换酶抑制剂等都对NADPH氧化酶的活性有着一定的抑制作用。因此，抗氧化剂的研究和使用在心血管疾病的治疗方面显得很重要，然而抗氧化药物的使用仍然停留在传统治疗药物中。虽然目前对于抗氧化剂在心血管疾病的应用有一定报道，但抗氧化剂尚未在临床中作为心血管疾病的常规用药，其临床疗效也有待评价。

本研究局限于基础研究，缺少动物实验乃至进一步临床研究，未能进一步研究心肌细胞内高水平氧化应激状态对心肌组织乃至整个心脏的具体影响。

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The changes of the expression of p22-phox before and after P19 cells differentiating into cardiac myocytes

Wu Jijun1，Han Weixing1，Liu Chao2，et al
（1Dept of Cardiovascular Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Tissue Engineering Stem Cell Institute of Histology and Embryology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the change of the expression of p22-phox before and after P19 cells differenti-ating to cardiac myocytes.MethodsAppropriate P19 cells were chosen which were cultured in vitro with 0.9% dimethyl sulfoxide（DMSO），then the induced cells were collected at different times.Western blot of cardiac troponin I（cTnI）was used to identify cell differentiation，and detect the level of p22-phox before and after the differentiation.Results①On the 8th day cTnI was detected positive in P19 cells which were cultured with 0.9%DMSO，then the expression of cTnI was increased，with statistical significance（P＜0.05）.②The expression of p22-phox in differentiated P19 cells was higher than that in undifferentiated P19 cells，with statistical significance（P＜0.05）.ConclusionThe expression of p22-phox increases during the differentiation of P19 cells to cardiac myocytes，and the level of oxidative stress increases.

P19 cells；cardiac myocytes；cell differentiation；oxidative stress；p22-phox

R 331

1000－1492（2015）01－0009－04

2014－09－21接收

国家自然科学基金（编号：81070210）

1安徽医科大学第一附属医院心血管内科，合肥 230022

安徽医科大学2组胚学教研室组织工程干细胞研究所、3诊断学教研室，合肥 230032

吴继军，男，硕士研究生；

韩卫星，女，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：hwx5712＠aliyun.com