自噬参与缺血性心脏病的发生发展

马梦晴，林先和

(安徽医科大学第一附属医院心血管内科，安徽合肥 230022)

缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)即冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)，又称冠心病(CHD)，是一种常见的心脏病。IHD主要由于长期心肌缺血导致心肌细胞供氧需氧失衡、能量代谢障碍、局限性或弥漫性纤维化，后期不可避免的会引起心功能障碍、心室扩张、心肌纤维化及重塑等一系列临床表现综合征。这主要是由于缺血后大量的心肌细胞丢失导致心脏收缩力进行性下降所致，最终不可避免的进入心力衰竭阶段，成为全世界患者死亡的一个主要因素［1］。对于缺血心肌，快速的血液再灌注成为治疗的关键，然而，尽管再灌注的有效性，再灌注之后的损伤仍旧严重威胁着心肌的存活。因此，明确理解心肌缺血发病的分子学机制并探索有效的治疗措施显得尤其重要和迫切。证据表明自噬参与许多心脏疾病的发病机制，基础水平的自噬可维持细胞的正常生理平衡，而病理状态下可作为一种应激的适应性反应而明显升高［2］，因此自噬被广泛的认为是一个潜在的治疗缺血性心脏病的靶点。

1 自噬

真核细胞系统主要包括泛素和自噬/溶酶体两个蛋白质降解系统。前者可选择性的通过降解短寿命蛋白来维持基本的细胞生命代谢，而后者则是应激时细胞维持内环境稳定的重要机制，它通过溶酶体降解胞内异常大分子蛋白以及损伤的细胞器，进而实现物质和能量的更新。自噬以胞质内出现自噬体为特征，早在20世纪50年代初，比利时科学家Christiande Duv便首次观察到了自噬体，并随后提出了自噬(autophagy)的概念［3］。

1.1 自噬的分类 自噬有多种分类方法，依据底物转运方式不同，自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)，其中巨自噬是最活跃和典型的自噬形式，也就是通常所说的自噬。微自噬中，溶酶体外膜通过突出、内陷、分隔方式直接摄取底物入溶酶体腔进行降解。CMA是一种仅存于哺乳动物且具有选择性的自噬类型，胞质中可溶性底物蛋白(常含有特异性KFERQ五肽模序)可被热休克蛋白70(heat shock protein of 70 kD，HSP70)特异识别，进而在溶酶体相关膜蛋白2α(1ysosome-associated membrane protein type-2α，LAMP2α)的协助下转位至溶酶体腔内进行降解。巨自噬和微自噬均无特异性，CMA具有特异性，但只能降解特定蛋白质而不能降解受损的细胞器。按能否与降解底物特异性结合，自噬也可以分为选择性自噬和非选择性自噬，前者需要特异性受体的参与［4］，其中P62是哺乳动物中目前研究较为清楚的自噬特异性受体［5］。选择性自噬根据细胞器的不同又可以分为线粒体自噬(Mitophagy)［6］、内质网自噬(Reticulophagy)［7］、核糖体自噬(Ribophagy)以及伴侣蛋白调节的自噬(Chaperonemediated autophagy)等。

1.2 自噬的相关基因(ATGs)及其调控过程 酵母是研究自噬的经典对象，其内发现了多种参与调控自噬的自噬相关基因(autophagy-related gene，ATG)，编码的分子也已被鉴定并统一命名为Atg。自噬进化上高度保守，从酵母到哺乳动物依赖于相似的核心系统，在哺乳动物体内大多数ATGs可找到相应的同源基因［8］。自噬途径的分子组成主要涉及到Atg1激酶复合物、mAtg9信号通路、磷脂酰肌醇3-羟激酶(PI3K)/Vps34复合体及两种泛素样蛋白共轭系统四个亚组，每个亚组都包含了多种ATG分子，在不同阶段不同部位对自噬调控发挥不同作用。

自噬过程可分为诱导膜体启动、囊泡转换及物质降解3个过程［9］。自噬诱导信号激活后，胞质内首先形成一来源于非溶酶体膜的双层膜结构，并不断向两边延伸成扁平状，也称为隔离膜或自噬前体。隔离膜逐渐包裹胞浆内的降解底物，形成密闭的囊泡结构，称为自噬体。随后，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，自噬体内膜和底物被溶酶体酶降解，产物被重复利用。自噬激活的每一过程中均涉及多种分子信号调控。自噬可通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyein，m-TOR)依赖性途径以及非m-TOR依赖性途径激活［10］，目前已知的自噬激活最经典的信号通路是以m-TOR为中心的信号系统。

m-TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的敏感感受器，为调控细胞生长与增殖的一个关键通路，可负性调控自噬［11］。自噬启动后，m-TOR可通过 RTKClassI PI3K-PIP3-PDK-1-Akt途径激活而抑制自噬［12］，同时，活化的RTK还可通过激活Ras-MAPKERK1/2信号通路促进自噬前体的形成而诱导自噬［13］。此外，作为能量代谢感受器的腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)不仅可以通过直接磷酸化P27诱导自噬发生，也可以通过磷酸化TSCl/2复合体抑制m-TOR激酶活性，进而激活自噬。

m-TOR激活可磷酸化核体蛋白S6(p70S6)，促进mRNA翻译，促使核糖体与内质网黏附，抑制自噬体膜的形成，阻碍自噬激活［14］。营养丰富状态下，m-TOR通过丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化Atg13，Atg1-Atg7激酶复合物进而与磷酸化的Atg13解离，Atgl激酶活性降低，抑制自噬的发生。相反，营养缺乏状态可通过抑制m-TOR的活性，促使Atg13去磷酸化并重新结合到 Atg1-Atg7激酶复合物，激活Atg1激酶，启动自噬的发生［15］。另一方面，Ⅲ类磷酸酰肌醇3激酶(ClassⅢ PI3K)激活后，与Beclin1(与酵母Atg6同源)及Vps34结合成的Beclin1复合物也可诱导自噬的发生。Beclin1由BH3结构域、CCD结构域以及进化保守的ECD结构域组成，Vps34与CCD及ECD相结合，营养充足的情况下，BH3结构域通过与BcL-2家族相结合而维持稳定状态，营养缺乏时，BcL-2与Beclinl分离，Beclin复合物激活释放而诱导自噬形成隔离膜［16］。

自噬启动后可引起一系列自噬相关分子连锁反应，该过程主要涉及到Atg5-Atg12-Atg16和LC3Ⅱ-PE两个泛素蛋白连接系统。首先，泛素活化酶Atg7和Atg10通过C端甘氨酸残基活化Atg12，并使其共价结合到泛素转移酶Atg5形成Atgl2-Atg5复合物。自噬发生时，同源二聚体Atg16-Atg16与一对 Atg12-Atg5非共价结合，形成 Atg12-Atg5-Atg16复合物并定位于隔离膜上［17］。另一方面，微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light-chain 3，LC3)在半胱氨酸蛋白酶(Atg4)作用下，分解暴露出C端甘氨酸残基，形成LC3-Ⅰ，之后被Atg7和Atg3(LC3特异性E2样蛋白)激活，在上游Atg16-Atg12-Atg5复合物的诱导下连接到1分子磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)形成LC3-Ⅱ，并定位到隔离膜上，随后诱导双层膜延伸并包绕胞内降解底物，最终形成双层膜结构的自噬体。自噬体形成后，Atg12-Atg5-Atg16复合物从隔离膜上脱落，而LC3-Ⅱ则停留在膜上，直至和溶酶体融合后才脱落，故许多研究中用LC3来检测自噬水平的高低，原因就在于此。其中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值测定更具代表性，因为它是一种自噬流水平的检测［18］，而非单纯的以自噬体有无或者数量多寡评价自噬，这可使自噬的检测更科学全面一些。

1.3 自噬的病理生理学效应 作为细胞维持内稳态平衡的管家机制，自噬广泛存在于真核生物生命活动中。自噬能调控过氧化物体、长寿蛋白以及细胞器的降解及更新，同时也作为一种防御机制抵御环境变化对细胞造成的损伤。当细胞遭受外源性刺激如氧化应激、营养缺乏、感染以及低氧等，自噬降解产物可为细胞的重建、再生和修复提供能量供给以及必需原料，维持细胞结构及功能的平衡［19］。过度的自噬可诱导不依赖于caspase酶的Ⅱ型程序性细胞死，自噬不足时，则可打破细胞原有的平衡，导致人体各个系统疾病的发生［20］。

自噬的异常可导致帕金森(Parkinson disease，PD)、阿尔茨海默病(Alzhecimer’s disease，AD)及亨廷顿病(Hunting’s disease，HD)等中枢神经系统疾病:激活线粒体自噬信号的异常是PD发生的原因［21］，AD 是由于自噬异常导致 β-淀粉样蛋白(Aβ)的过多沉积所致，HD的病理改变也与自噬水平异常所导致的huntingtin蛋白聚集有关［22］。研究表明，自噬异常也可导致错误蛋白聚集在肝脏而致瑞士综合征(Reye’s Syndrome)中［23］，而鼠模型中用药物激活自噬则显现出了对肝脏的保护作用［24］。此外，自噬还涉及在诸多肿瘤相关性疾病及衰老［19］的病理生理机制中。

2 自噬和心脏疾病

心肌细胞是一种无再生能力的高分化终末细胞。应激时，心肌细胞可通过自噬过程对物质及能量进行更新，以维持心脏功能和细胞存活。心肌富含线粒体，不良刺激容易导致线粒体受损同时释放细胞色素C等促凋亡因子，而自噬能降解、回收并选择性移除受损线粒体，抑制凋亡发生。越来越多的证据表明自噬的异常可促进许多心血管疾病的发生与发展。自1976年心肌细胞自噬被报道以来，自噬与心血管疾病的关系日益为研究者们所重视并成为研究的热点。目前，由于自噬的研究没有达成统一的规范化标准，国内外不同层次水平的众多研究中，自噬所起作用并不完全相同，甚至出现完全相悖的结论。

2.1 心肌缺血再灌注损伤(I/R)和自噬 心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)损伤的病理生理过程涉及到自噬的参与，但其具体分子机制仍旧不明，大家对在心脏I/R过程中自噬所起正性或负性作用仍旧没有统一观点，这可能与不同阶段的自噬活动可由不同的信号分子调控有关。研究认为自噬在缺血早期发挥的保护作用可能通过AMPK介导，而再灌注过程中则可能通过Beclin1发挥损伤作用。心脏缺血阶段，低氧、ATP减少及损伤细胞器均能激活自噬，自噬产生的降解产物如脂肪酸、氨基酸等被用来产生能量，成为心肌细胞缺氧耐受的重要调节机制。通过手术造成心肌缺血的小鼠模型中，于缺血30 min后即可检测到大量的自噬小体。研究也表明，I/R后尽管能量危机缓解，但其他促自噬机制如氧化应激、线粒体损伤、内质网应激及炎症反应却可进一步激活自噬。经过40 min缺血和再灌注的家兔心脏模型中也观察到了自噬活动的明显增强。随后，诸多不同动物模型实验也证明了心肌缺血后自噬活动增强，而再灌注时自噬进一步加强［25-26］。

研究表明自噬激活在心脏I/R中是具有心肌细胞保护作用的。哺乳动物mTOR抑制剂雷帕霉素预处理能减轻I/R损伤，提示了mTOR途径介导的自噬保护作用［11］。离体实验的I/R模型中，过度表达Atg5、Beclin1或给予雷帕霉素预处理上调自噬，HL-1或离体培养的大鼠心肌细胞死亡减少，损伤耐力也增强，而当给予RNAi或3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine，3-MA)抑制自噬时，细胞凋亡和坏死均明显增多。此外，猪心肌反复顿抑后自噬增加、凋亡减少的实验也提示自噬了具有抑制凋亡的作用，同时如果抑制缺血预处理所诱导的自噬，则缺血预处理对心脏的保护作用就会消除［27］。心肌细胞无再生能力，而心脏又是高耗能的器官，故在缺血再灌注过程中能否维持能量平衡直接决定这细胞的存亡。自噬的保护作用在于它能清除I/R过程中产生的释放促凋亡因子的受损线粒体的堆积以及内质网等有害物质，进而抑制凋亡的发生并促进物质的更新。另一方面，蛋白酶降解系统在I/R过程受到抑制、功能不全时，白噬可以与其协助互补降解毒性蛋白产物，从而减轻IR损伤口［28］。

然而，当自噬对细胞内容物的消化超过一定限度时，自噬在I/R过程中也表现出促心肌损伤作用。大鼠H9c2心肌饥饿细胞模型中当阻断Beclin1或者药物抑制自噬时可减少细胞凋亡，Beclin1敲除的小鼠模型由于自噬水平的下降，其再灌注时的凋亡水平和心梗面积也有了明显的减少。所有这些研究结果显示，心肌缺血阶段虽然可通过AMPK途径激活的自噬对心脏进行保护，但再灌注阶段通过Beclin1途径激活的自噬对心脏却表现出损伤性的作用。我们都知道物极必反的道理，生物体内任何反应过程都是动态变化而非绝对的，自噬也是一样。心肌缺血阶段，自噬可以通过降解损伤性的物质进行代偿，但当再灌注导致的应激性损伤物质如自由基等进一步增多，并远远超过自噬生理水平，或者自噬的激活赶不上损伤物质增加的速率时，自噬便不能继续发挥原来的保护机制。再灌注阶段，自噬的过度激活往往伴随着溶酶体酶的明显增加，这可导致正常蛋白质及细胞器的降解，从而诱导不可逆性的细胞死亡。其次，BcL-2和Beclin1之间的平衡也往往决定着这自噬对细胞存亡的作用。BcL-2可负性调节 Beclin1的促自噬作用，再灌注时BNIP3的增加以及BcL-2的下降都会加剧Beclin1诱导自噬的激活，但升高的BNIP3本身就具有增加超氧化物、促进凋亡因子产生及破坏线粒体完整性的作用，而BcL-2是一种抗凋亡蛋白。最后，自噬和凋亡也存在着某些共同的作用通道。例如参与自噬过程的Atg5本身就能直接与凋亡相关蛋白相互作用而诱导自噬性的细胞死亡。此外，也有报道认为诱导自噬增强的Beclinl的BH3结构域也具有直接激活凋亡的能力，故当其促凋亡能力超越所激活自噬的保护作用时，就可表现为I/R的损伤作用。

2.2 心肌肥厚和自噬 心肌肥厚指心肌纤维的增粗，往往发生在超负荷条件下，也是缺血性心脏病发展到一定程度出现的病理改变。当心脏需求量增加时，无再生能力的心肌细胞首先发生代偿性的向心性肥大来增加心输出量。压力持续性存在时，则表现为心功能失代偿的离心性肥大，导致心肌细胞变长，室壁变薄，心室病理性重塑，最终演变为进行性加重的心衰、心律失常、栓塞甚至猝死，预后差，死亡率高，目前尚无特异性治疗方法。

多研究表明，自噬参与心肌细胞大小及整体心脏结构和功能的代偿性调节。敲除Atg5基因的动物模型早期虽无异常表现，但增加后负荷后，则出现了左心室的扩张以及心功能障碍，成年后则导致了快速的心脏肥厚、心室扩张及收缩功能异常，RNAi抑制Atg7也可诱导新生大鼠心肌细胞肥大。雷帕霉素可通过激活自噬对压力超负荷下形成的心肌肥大有明显的改善作用。然而，亦有报道认为自噬参与促进了心肌肥大的发生与发展，心脏特异性表达mTOR的转基因小鼠模型中，和对照组相比，横断型主动脉缩窄(TAC)后出现的心肌肥大、纤维化以及炎症反应均减轻［29］。

疾病的损伤程度及自噬水平的不同可能导致了自噬在心肌肥大中不同甚至相反的作用。心肌肥大的早期可通过AKT1-mTOR介导的自噬抑制发挥调节作用，而后期心肌细胞持续性的肥大可造成血供不足，继而诱导自噬的增强。既往TAC模型实验发现，Beclin1诱导自噬增强的小鼠心功能及病理性重塑均较对照组减少，但当自噬进一步加强后，模型组的心功能及心肌病理性重塑均较对照组恶化。这些研究表明，压力超负荷初期，自噬可通过提高心肌细胞抗压能力而起到保护作用，但当负荷过重时，进一步的自噬却可以促进疾病的进展，从而导致病理性的心肌重塑。

2.3 心肌纤维化与自噬 心肌纤维化指心脏中成纤维细胞增生并向肌成纤维细胞转化，而后者产生的胶原2倍于前者，胶原降解也减少，最终可导致胶原纤维过量沉积在胞外基质并伴有各型胶原的比率失调和排列紊乱。心肌纤维化涉及在各种各样心脏疾病的病理变化过程中，包括缺血性心肌病、心律失常、慢性心衰及冠状动脉粥样硬化性心脏等。而自噬作为细胞应激状态下的一种内稳态平衡机制，也可能涉及在心肌纤维化的发病机制中。研究表明，糖尿病小鼠动物模型中，自噬可通过氧化应激激活并抑制了心肌细胞间质增生及纤维化浸润。然而，也有实验发现在通过粒细胞刺激因子减少细胞自噬水平的地鼠模型中，其心肌间质的纤维化轻于对照组，心脏收缩功能也高于对照组［30］。目前，心肌细胞纤维化的发生与自噬之间的机制尚未完全阐明，自噬在心肌纤维化的发病机制中到底起抑制作用还是促进作用，以及其与心脏纤维化的发生发展有无时间相关性，还需进一步的动物模型及临床试验研究。

2.4 心力衰竭和自噬 心力衰竭(heart failrue，HF)为各种心脏病发展的终末期阶段。尽管内科药物治疗(包括ACEI、β受体阻滞剂、利尿剂)及外科心脏再同步化治疗、植入型体内自动除颤器等器械治疗可一定程度上改善心衰症状，但其死亡率仍旧很高。因此，详细阐述心衰发病机制并研发新的治疗方法显得尤为重要。近年来越来越多的研究表明自噬参与HF的发生发展过程，自噬存在于人类心脏病中的证据最初就是来源于27例终末期心衰移植的心脏超微结构分析［31］。应激早期，自噬的上调可以有效清除受损线粒体，消除过多的活性氧产物，起到心脏保护作用，而抑制自噬则促进了心肌细胞死亡［32］。当心脏处于缺氧缺血，超压力负荷等持续应激状态时，为适应环境，心肌细胞便发生重塑，进而影响心功能。尽管很多证据显示自噬源性的细胞死亡也可能是导致心衰的病因，高压力负荷诱导的自噬可加重心肌功能不全并参与心衰的发生，但关于自噬上调和HF的因果关系仍尚未明确。

3 结论及展望

自噬普遍存在于细胞的正常生理及病理过程中，它能通过清除细胞内过量或受损的细胞器和蛋白质来维持内稳态平衡，但自噬的不足及过度又可导致相关的疾病。缺血性心脏病无论是在发病的缺血阶段还是后期导致的心肌肥厚、心肌纤维化以及心衰的病理改变上，甚至在再灌注治疗后的疗效上均涉及到细胞自噬的复杂调控。随着研究不断的深入，自噬在缺血性心脏病中的作用日益成为学者们关注的焦点，其在疾病发生发展中的分子学机制及具体作用也正被逐步揭示，目前自噬在心血管领域被研究的热点主要集中在内质网应激、线粒体自噬以及泛素—蛋白酶体系统等方面。

自噬水平的靶向治疗可能对许多疾病都发挥积极的作用。目前，临床已经开展了靶向自噬用于相关疾病特别是血管性疾病的治疗［33］。针对缺血性心脏病，临床上则主要是从自噬信号途径比如mTOR、PI3K/AKT、P27等信号通路上加以干涉，通过基因修饰技术对自噬途径中的关键信号分子在冠心病进展不同阶段进行有效调节，以此达到治疗心血管疾病的目的。近年来，虽然在自噬分子水平机制上的研究，包括自噬的起源、信号的调控等已取得重大进展，但关于自噬对缺血性心脏的保护性和致病性仍需进一步深入探讨，相信随着人们对生物化学、遗传学以及信号转导等研究的不断深入，靶向自噬用于缺血性心脏病的干预以及相关自噬抑制剂的使用将为心血管疾病的治疗开辟一新的领域。

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